ГОСТ 25582-83

• '1

                             УДК 636 : 576.8.07 : 006.354                                        Группа С79
                             Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й          С Т А Н Д А Р Т     С О Ю З А     ССР


                                         ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
                                        Методы лабораторной диагностики
                                                                                            ГОСТ
                                         инфекционного ларинготрахеита
                                               Agricultural poultry.
                                                                                       25582-83
                                        Methods of laboratory diagnostics
                                          of infectious laringotracheitis              [CT СЭВ 1743— 79)



                             Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 6 января
                             1982 г. Ns 17 срок действия установлен
                                                                                            с 01,07.83
                                                                                          до 01.07.88
                                              Несоблюдение стандарта преследуется по закону

                          Настоящий стандарт распространяется на кур и фазанов и уста­
                       навливает методы лабораторной ' диагностики инфекционного ла­
                       ринготрахеита.
                          Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы
                       в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреж­
                       дений.
                          Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1743—79.
                                                            1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

                       1.1. Для вирусологического исследования берут пробы патоло­
                   гического материала — часть слизистой оболочки гортани, трахеи,
                   конъюктивы, носовых ходов (включая экссудаты) и легких от
                   только что павших или убитых с диагностической целью птиц в
                   начальной фазе их заболевания — на 2—7 сут.
                      Отобранные пробы замораживают и до проведения исследова­
                   ний сохраняют при температуре минус 20°С и ниже.
                      1.2. Для серологического исследования берут на 14 и 28 сут
                   от начала болезни кровь по’5 см3 не менее чем от пяти голов пти­
                   цы. Отделяют сыворотку крови и до начала исследований сохра­
                   няют ее (не добавляя консервантов) в замороженном состоянии
                   при температуре минус 20°С и ниже.




                 Издание официальное                                                Перепечатка воспрещена


строительство дачного дома

Стр. 2 ГОСТ 25582—83

                       2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

   2.1. М е т о д в ы д е л е н и я в и р у с а
   Сущность метода заключается в выделении возбудителя забо­
левания на куриных эмбрионах или на культуре клеток.
   2.1.1. Аппаратура и материалы
   Для проведения исследования применяют:
   термостат или инкубатор вакуумный с температурой нагрева
37—38°С;
   ступки фарфоровые;
   центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000—
5000 об/мин;
   измельчитель ткани;
   пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82;
   флаконы;
   термометр;
   шприцы с иглами;
   пенициллин;
   стрептомицин;
   эмбрионы куриные 9—12-суточного возраста;
   культуру клеток почек куриных эмбрионов и цыплят;
   гидролизат лактальбумина 0,5% в растворе Хенкса.
   2.1.2. Подготовка к исследованию
   Пробы патологического материала, взятые для выделения ви­
руса, гомогенизируют в изотоническом буферном растворе в кон­
центрации 1 : 5 с помощью измельчителя ткани или в ступке с
кварцевым стеклом. Смесь центрифугируют с частотой вращения
1500—2000 об/мин в течение 10—15 мин. Надосадочную жид­
кость сливают, добавляют по 1000 ЕД пенициллина и стрептоми­
цина на 1 см3 суспензии и выдерживают в течение 3—12 ч пои
2—4°С.
    2.1.3. Проведение исследования
    При выделении вируса на куриных эмбрионах для каждой
пробы используют по 10 куриных эмбрионов. Полученную после
обработки пробы суспензию инокулируют на хориоаллантоисную
оболочку или в хориоаллантоисную полость в количестве 0,1 —
0,2 см3. "Зараженные эмбрионы одновременно с контрольными ин­
кубируют при температуре 37°С в течение 8 сут. Эмбрионы овос-
копируют не реже чем один раз в сутки. Эмбрионы, погибшие в
первые 24 ч, отбрасывают, а эмбрионы, погибшие позже, удаляют
и сохраняют в холодильнике при температуре 4°С. Оставшиеся
живые эмбрионы убивают на 6—8 сут после инокулирования ох­
лаждением в течение 2—3 ч при 4°С.
  10

ГОСТ 25582—83 Стр. 3


    2.1.4. Обработка результатов
    2.1.4.1. Гибель эмбрионов в течение 4—6 сут свидетельствует
о наличии вирулентного штамма вируса инфекционного ларин-
готрахеита. Гибель эмбрионов позднее указанных сроков или от­
ставание эмбрионов в развитии по размерам и массе свидетельст­
вует о заражении более мягкими штаммами вируса.
    2.1.4.2. Для выявления специфических поражений куриного
эмбриона проводят дополнительно 2—3 пассажа.
    Для последующего пассажа вируса используют для зараже­
ния хориоаллантоисную оболочку, суспензированную в алланто­
исной жидкости, и весь эмбрион.
    Специфические поражения куриных эмбрионов, погибших че­
рез 3—5 сут после заражения, характеризуются: помутнением и
утолщением хориоаллантоисной оболочки, наличием мелких
 (мелкозернистые, величиной 1—4 мм) или крупных (диаметром
 5—7 мм) бляшек от серого до желто-белесого ^цвета различной
 морфологии — круглые, плоские или неправильной формы.
    2.1.4.3. Выделение вируса подтверждают установлением внут­
 риклеточных включений (телец Зейфрида), реакцией нейтрализа­
 ции, реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле или
 биопробой. Идентификацию вируса проводят также методом им­
 мунофлуоресценции и электронной микроскопии.
    2.1.4.4. При заражении вирусом инфекционного ларинготра-
 хеита культуры клеток почек куриных эмбрионов и цыплят цито-
 патический эффект появляется на 4—6 сут после инокулирова-
 ния. Наблюдают множество многоядерных поликариоиитов. Под
 микроскопом обнаруживают внутриядерные включения. Специ­
 фичность этих изменений доказывают иммунофлуоресценцией или
 с помощью специфических сывороток в реакции нейтрализации.
     2.2. М е т о д п о с т а н о в к и б и о п р о б ы
     Сущность метода заключается в воспроизведении инфекцион­
 ного ларинготрахеита на цыплятах. Метод позволяет определить
 вирулентность штамма, а также провести дифференциацию его от
 вирусов, вызывающих сходное поражение хориоаллантоисной обо­
 лочки у инфицированных куриных эмбрионов.
     2.2.1. Аппаратура и материалы
     Для проведения исследования применяют аппаратуру и мате­
 риалы, указанные в п. 2.1.1, и дополнительно:
     пипетки пастеровские.
     2.2.2. Проведение исследования
     Биопробу ставят на цыплятах 1—2,5-месячного возраста путем
 внутритрахеальной аппликации вируссодержащего материала и
 втирания его в слизистую оболочку клоаки.
     За выжившими цыплятами наблюдают в течение 10—14 сут.
                                                             11

Стр. 4 ГОСТ 25582—83


   Для исключения вируса оспы кур, вызывающего на хорио-
аллантоисной оболочке поражения, сходные с вирусом инфекци­
онного ларинготрахеита, заражают цыплят 30—60-суточного воз­
раста методом аппликации вируссодержащего материала в ска­
рифицированные перьевые фолликулы голени, гребешок и гор­
тань.
   2.2.3. Обработка результатов
   Инфекционный ларинготрахеит диагносцируют при появлении
у зараженных цыплят на 3—7 сут, но не позднее 12 сут клини­
ческих признаков: кашля, хрипов, поражений гортани, ринита.
   У птиц, зараженных клоачно, наблюдается воспаление слизис­
той оболочки. Некоторые более мягкие штаммы, даже и в боль­
ших дозах, вызывают только хрипы и истечения из носа. Оспен­
ная реакция у зараженной птицы проявляется на 6—8 сут в фор­
ме припухания и покраснения фолликул и образования ложных
дифтеритических наложений в ротовой полости. При вирусоскопии
по Морозову в мазках из развившихся фолликул обычно обнару­
живают оспенные элементарные тельца.
   2.3. С е р о л о г и ч е с к и й м е т о д
   Сущность метода заключается в выявлении у птиц специфичес­
ких антител в реакции нейтрализации (PH).
   2.3.1. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
   Для проведения исследования применяют:
   баню водяную;
   термостат с температурой нагрева 37—38°С;
   холодильник с морозильной камерой;
   штативы;
   горелки газовые или спиртовые;
   пробирки бактериологические;
   пробки резиновые;
   пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5, 10 и 100 см3 по
ГОСТ 20292—74;
   измельчитель ткани;
   потенциометр;
   чашки Петри по ГОСТ 25336—82;
   стекла предметные по ГОСТ 9284—75;
   натрий хлористый по ГОСТ 4233—77;
   воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72;                      ;
   пенициллин;
   стрептомицин;
   эмбрионы куриные 9—12-суточного возраста;
   культуру клеток почек куриных эмбрионов и цыплят;
   среды питательные для культуры клеток.
 12