ГОСТ 29184-91

ГОСТ 29184-91


                 М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й            С Т А Н Д А Р Т




                             ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
                         МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                               КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ
                           СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE



                                      Издание официальное




                                            Ст м ц иш|ф |||1И
                                                  2010




постройка дома

УДК 663/.664:543.9:006.354                                                                           Группа Ц09



М    Е       Ж   Г   О   С   У    Д   А   Р   С   Т   В   Е    Н   Н   Ы   Й       С Т А Н Д А Р Т


                             ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

             Методы выявления и определения количества бактерий
                        семейства Enterobacteriaceae                                          ГОСТ
    Food products. Methods for detection and quantity determination of family
                                                                                            29184-91
                              Enterobacteriaceae

МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109


                                                                                          Дата введения 1)1.01.93


      Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления
в определенной навеске пищевого продукта бактерий семейства Enterobacieriaceae и два метода опреде­
ления их количества: метод наиболее вероятного числа (НВЧ) и метод посева на поверхность селектив­
но-диагностической среды.
      Методы выявления и определения наиболее вероятного числа основаны на высеве продукта
и (или) его разведений в жидкую селективную среду, инкубировании посевов при температуре
(37 ± 1) 'С в течение 24—48 ч. пересеве выделенной культуры на поверхность селективно-диагности­
ческой среды, подтверждении по биохимическим признакам роста принадлежности выделенных коло­
ний к бактериям семейства Enterobacteriaceae.
      Метод определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на поверхность
агаризованной среды основан на высеве 0.1 или 0.2 см' продукта или его разведений на поверхность
селективно-диагностической среды, инкубировании посевов при (37 ± 1) *С в течение 24 ч, подтвер­
ждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к бактериям семейства
Enterobacteriaceae.
     Требования настоящего стандарта яатяются обязательными.

                                      1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

      Отбор проб и подготовка их к испытанию - по ГОСТ 26668 и ГОСТ 26669.

                                 2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

      Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со
следующими дополнениями:
      весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания до
200 г и пределом допускаемой погрешности ± 2 мг (для взвешивания реактивов);
      весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания
до I кг и пределом допускаемой погрешности ± 10 мг (для взвешивания продукта);
      микроскоп световой биологический, обеспечивающий увеличение в 900—1000";
      поплавки (трубки Дархема);
      стекла предметные по ГОСТ 9284;

    • С 1 июля 2002 г. висдсн в действие ГОСТ 24104—2001. На территории Российской Федерации действует
ГОСТ Р 53228—2008 (здесь и далее).

Издание официальное                                                                      Перепечатка воспрещена
         ★
                                                                               ф Издательство стандартов. 1992
                                                                                © СТАНДАРТЕ!НФОРМ, 2010
                                                          90

ГОСТ 29184-91 С. 2

     стекла покровные по ГОСТ 6672;
     термостат с диапазоном рабочих температур 28-55 'С , позволяющий поддерживать заданную
температуру с погрешностью ± 1 *С;
     бриллиантовый зеленый;
     генцианвиодет:
     диметил-л-феннлендиамин;
     желчь говяжья сухая или натуральная;
     метиловый фиолетовый;
     N, N, N'. Л" - тетраметил-пара-фениленднамина дигидрохлорид;
     индикаторные бумажки на оксндазу, выпускаются Дагестанским НПО «Питательные среды»
и Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии.

                               3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

      3.1. Приготовление растворов
      3.1.1. Щелочной раствор бромкрезолового пурпурного концентрацией 10 г/дм5: 1 г бромкре-
золового пурпурного переносят в фарфоровую ступку с 19см5 раствора гидроокиси натрия концентра­
цией 0,1 моль/дм’ и после растворения добавляют 80 см5 дистиллированной воды. Раствор хранят в
закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.
      3.1.2. Раствор бриллиантового зеленого концентрацией 5 г/дм3: 0.5 г бриллиантового зеленого
переносят в мерную колбу вместимостью 100 см5 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор
хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.
      3.1.3. Раствор генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метилового фиолетового
концентрацией 10 г/дм5: I г одной из анилиновых красок переносят в мерную колбу вместимостью
100 см5 и доводят дистиллированной водой до метки.
      3.1.4. Растворы и реактивы для окраски по Граму по ГОСТ 10444.1.
      3.1.5. Растворы для определения оксидазы готовят непосредственно перед применением.
      3.1.5.1. Раствор jV. iV, jV* N ' - тетраметил-пара-фениленднамина дигидрохлорида концентрацией
10 г/дм’: 1 г реактива переносят в мерную колбу вместимостью 100 см', растворяют в дистиллирован­
ной воде температурой 10—15‘С.
      3.1.5.2. 30-40 мг а-нафтола растворяют в 2.5 см ’ ректификованного этилового спирта, добавля­
ют 7,5 см5дистиллированной воды и 4 0 - 60 мг диметил-л-фенилендиамина.
      3.2. Приготовление питательных сред
      3.2.1. Среда Кесслера: 10.0 г пептона. 2.5 г глюкозы. 5,0 г сухой говяжьей желчи или 50 см5
натуральной желчи, 2.0 см5 раствора генцианвиолета или кристаллического фиолетового, или метило­
вого фиолетового, приготовленных по п. 3.1.3, добавляют к 1000 см5 дистиллированной воды, тща­
тельно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1—2 мин, фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45—55 "С, устанавливают pH таким образом, чтобы после
стерилизации он составлял при 25 *С (7.3 ± 0,2), рахчнвают по 10 см5 в пробирки с поплавками и
стерилизуют 20 мин при температуре (114 ± I) *С.
      3.2.2. Буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью: 10.0 г пептона.
5.0 г глюкозы, 6.45 г двузамешенного фосфорнокислого безводного натрия, 2,0 г однозамещенного
фосфорнокислого безводного калия, 20,0 г сухой говяжьей желчи или 200 см' натуральной желчи,
3.0 см’ раствора бриллиантового зеленого, приготовленного по п. 3.1.2, добавчяют к 1000 см5
дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят
1 -2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 4 5 -5 5 *С и устанавливают pH
таким образом, чтобы он составлял при 25 ’С (7.2 ± 0.1), после чего среду доводят до кипения.
      Среда не подлежит стерилизации в автоклаве, ее разливают по 10 см' в стерильные пробирки с
поплавками.
      3.2.3. Бульон Мак-Конки: 20,0 г пептона. 10,0 г глюкозы, 5.0 г хлористого натрия, 5,0 г сухой
говяжьей желчи или 50 см' натуральной желчи, 1,0 см5 раствора бромкрезолпурпура. приготовленного
по п. 3.1.1, добавляют к 1000 см' дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения,
кипятят 1—2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55 ’С и устанавливают
pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 ‘С (7,2 ± 0,1), разливают по 10 см5
в пробирки с поплавками и стерилизуют 15 мин при температуре (121 ± 1) *С.
                                                91

С. 3 ГОСТ 29184-91

     3.2.4. Среда Кода выпускается Дагестанским НПО «Питательные среды*, готовится по прописи,
указанной на этикетке, но при приготовлении на 1 дм3 среды добаачяют 10,0 г глюкозы.
     3.2.5. Среды двойной концентрации готовят по пп. 3.2.1-3.2.4, но при Приготовлении берут
удвоенную массу (объем) ингредиентов, кроме дистиллированной воды, и рапивают в посуду с
учетом последующего количества добавляемого продукта.
     3.2.6. Среда Эндо выпускается Дагестанским НПО «Питательные среды* и готовится по прописи,
указанной на этикетке.
     3.2.7. Среду Гисса готовят по ГОСТ 10444.1 или используют среду, выпускаемую Дагестанским
НПО «Питательные среды», и при этом она готовится по прописи, указанной на этикетке.
     3.2.8. Мясо-пептонный агар по ГОСТ 10444.1.
     3.2.9. Среда, приготовленная из сухого питательного агара, выпускаемого Дагестанским НПО
«Питательные среды».

                                 4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

     4.1. Определение количества бактерий семейства Enterobacteriaceae
     4.1.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669
так, чтобы можно было определить в I г (см3) предполагаемое количество бактерий семейства
Enterobacteriaceae или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкрет­
ный продукт.
     4.1.2. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae по методу НВЧ
высевают три последовательные навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся по количе­
ству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение в трехкратной
повторности высевают в колбы или пробирки с одной из питательных сред по пп. 3 2.1 -3.2.4.
     Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной
средой 1:9.
     4.1.3. При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae посевом на агаризо-
ванную среду по 0.1 или 0,2 см1 навески продукта или его разведения наносят па поверхность двух
параллельных чашек Петри с агаризованной средой по п. 3.2.6. Подготовку чашек Петри со средой
к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
      При определении количества бактерий семейства Enterobacteriaceae методом мембранных фильт­
ров по ГОСТ 26670 фильтры переносят на поверхность среды Эндо, избегая образования пузырьков
воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть
обращена вверх.
     4.2. Определение присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae
      При определении присутствия (отсутствия) бактерий семейства Enterobacteriaceae в определенной
навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из
питательных сред по пп. 3.2.1 —3.2.4.
     4.3. Посевы инкубируют при (37 ± 1) *С на жидких средах в течение (48 ± 3) ч. а на твердой -
(24 ± 3) ч. Чашки с посевами на среде Эндо инкубируют дном вверх. Посевы на жидких средах
просматривают через (24 ± 3) ч и отмечают положительные пробирки, а окончательный учет проводят
через (48 ± 3) ч.
     4.4. Положительными считают пробирки, в которых имеет место интенсивный рост микроорга­
низмов, проявляющийся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (то есть измене­
нии цвета среды).
     4.5. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к бак­
териям семейства Enterobacteriaceae делают пересевы штрихами на поверхность среды Эндо так, чтобы
получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют при (37 ± 1) *С в течение (24 ± 3) ч.
     4.6.11осевы на твердых средах по пп. 4.2 и 4.5 после термостатирования просматривают и отмечают
рост характерных колоний. На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии
темно-красные с металлическим блеском или без него, розовые, прозрачные.
      В посевах по п. 4.2 отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. При
посеве методом мембранных фильтров на них подсчитывают колонии и в том случае, если их менее 15.
     4.7. Из чашек с посевами по пп. 4.2 и 4.5 отбирают не менее чем по 5 колоний для подтверждения
принадлежности их к бактериям семейства Enterobacteriaceae.
                                                 92