ГОСТ 28573-90

ГОСТ 28573-90


                            М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й              С Т А Н Д А Р Т




                                                     СВИНЬИ

                                          МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
                                                 АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ



                                                    Изданнс официальное
                          БЗ 9 -2 0 0 4




                                                            Иоси*
                                                        С тш р п ж ф о р н
                                                              ХЖ




энергоаудит предприятий

УДК 636.4.001.4:006.354                                                                              Группа С79


 М   Е   Ж   Г   О    С    У   Д   А   Р   С    Т   В    Е   Н    Н   Ы   Й        С Т А Н Д А Р Т


                                    СВИНЬИ

          Методы лабораторной диагностики африканской чумы
                                                                                              ГОСТ
                      Pigs. M ethods o f laboratory diagnostics                            28573-90
                                 o f african plague

М КС 65.020.30
ОКСТУ 9809

                                                                                          Дата введения 01.01,91




     Настоящий стандарт распространяется на свиней и устанавливает методы лабораторной диа­
гностики африканской чумы.
     Стандарт предназначен для диагностирования заболевания свиней в ветеринарных лаборато­
риях и ветеринарных научно-исследовательских учреждениях.

                                        1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

     1.1. Ятя проведения исследований от вынужденно убитых больных и павших свиней берут
пробы органов и тканей — лимфатических узлов (подчелюстной, протальный и мезентериальный),
селезенки, легкого, крови и костного мозга.
     Пробы берут не позднее чем через 10 ч после убоя или гибели животных.
     1.2. Пробы органов и крови хранят и транспортируют в термосе при 4 *С—8 *С не более 24 ч
после отбора. При более длительном хранении пробы замораживают.

                          2.   МЕТОД ПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

     Сущность метода заключается в соединении специфических иммуноглобулинов африканской
чумы свиней (АЧС), меченных флуоресцеинизотиоцнанатом (ФИТЦ). со специфическим антигеном
вируса АЧС в зараженных клетках и обнаружении комплекса «антиген-антитело» люминесцентной
микроскопией.
     2.1. Аппаратура, материалы и реактивы
     Микроскоп люминесцентный.
     Криостат.
     Термостат.
     Автоклав.
     Холодильник бытовой.
     Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту вращения 5000 м и н 1.
     Шприцы по МРТУ 46-23.
     Байка цилиндрическая по ГОСТ 25336.
     Стекла покровные по ГОСТ 6672.
     Стекла предметные по ГОСТ 9284.
     Пипетка пастеровская.
     Калий фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198.
     Натрий фосфорнокислый двузамешепный по ГОСТ 11773.
     Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Издание официальное                                                                     Перепечатка воспрещена

                                                                              £> Издательство стандартов, 1990
                                                                                     © Станлартинформ, 2005

С. 2 ГОСТ 28573-90

     Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
     Ацетон по ГОСТ 2603.
     Эфир этиловый по ГОСТ 22300.
      Парафин по ГОСТ 23683.
      Глицерин для микроскопии по ГОСТ 6824.
     Гепарин.
      Раствор фосфатный буферный pH 7.2—7.4.
     ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.
     ФИТЦ-иммупоглобулнны классической чумы свиней (КЧС).
      Вила дистиллированная.
     2.2. Подготовка к анализу
     2.2.1. Приготовление фосфатного буферного раствора pH 7,2—7,4
      Раствор А. В I дм3 дистиллированной воды растворяют 1,78 г двузамещенного фосфорнокис­
лого натрия.
      Раствор Б. В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 1.36 г однозамешейного фосфорно­
кислого калия.
      К 850 см3 раствора А добавляют 250 см3 раствора Б. В 1 дм3 полученной смеси растворяют 8,5 г
хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют в автоклаве в течение 2,5 ч при 2 атм.
     2.2.2. Приготовление буферного раствора глицерина
     9 см3 глицерина смешивают с 1 см3 фосфатного буферного раствора.
     2.2.3. Приготовление тест-пренаратов (срезов, мазков-отпечатков)
     2.2.3.1. От лимфатических узлов (подчелюстного, портального и мезентериального), селезенки
и легких двух-трех свиней при помощи криостата берут пробы массой 5—10 г. Из проб готовят срезы
толщиной 5 мк и помещают их на покровные стекла, предварительно обезжиренные смесью спирт-
эфира в соотношении 1:1. Из каждого органа готовят четыре тест-препарата.
     2.2.3.2. Из лейкоцитов крови больных и интактных свиней готовят мазки-отпечатки. Для
этого из краниальной полой вены берут 10—15 см3 крови в пробирку, содержащую гепарин
10—20 ЕД/см3. Кровь в пробирке осторожно перемешивают и выдерживают 30 мин при темпе­
ратуре 37 *С. Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами, переносят в центрифуж­
ную пробирку и центрифугируют 10 мин с частотой вращения 1000 м и н -1. Надосадочпую
жидкость удаляют, а лейкоциты осадка наносят на покровные стекла и готовят по четыре
мазка-отпечатка на одну пробу крови.
     2.2.3.3. Тест-препараты высушивают при комнатной температуре в течение 15—20 мин, поме­
щают в сосуд с ацетоном, выдерживают 10—15 мин при температуре минус 10 *С и подсушивают на
воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.
     2.3. Проведение анализа
      Подготовленные тест-пре параты обрабатывают ФИТЦ-иммуноглобулинами АЧС и КЧС.
Для этого на предметные стекла, помещенные во влажную камеру, наносят капли ФИТЦ-имму-
ноглобулинов и на них помешают тест-препараты срезом или мазком-отпечатком вниз. Камеру
помещают в термостат и выдерживают 30 мин при температуре 37 *С. Затем тест-препараты
промывают в фосфатном буферном растворе в течение 10 мин дважды со сменой раствора,
ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают при комнатной температуре и помешают
на капли раствора глицерина, нанесенные на предметные стекла. Края предметных стекол
окантовывают расплавленным парафином. Тест-препараты просматривают иод люминесцентным
микроскопом.
     2.4. Оценка результатов
      В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, зараженных вирусом АЧС и обработанных
ФИТЦ-иммуноглобулином АЧС, специфический антиген обнаруживают по свечению зеленого или
желто-зеленого цвета в форме отдельных гранул (включений) в перинуклеарной зоне на фоне
диффузного свечения зеленого или желто-зеленого цвета цитоплазмы клеток лимфоидного ряда или
макрофагов.
      В клетках тест-препаратов органов и крови свиней, не зараженных вирусом АЧС, обнаружи­
вают тусклое свечение клеток серо-зеленого цвета.
      При обработке ФИТЦ-иммуноглобулином КЧС тест-препаратов, приготовленных из проб
органов и крови свиней, больных КЧС, обнаруживают ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток,
часто расположенных группами.

ГОСТ 28573-90 С. 3

 3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

     Сущность метода заключается в инокуляции культуры лейкоцитов или костного мозга свиньи
исследуемого материала и обнаружении реакции гемадсорбиии или вирусоспеиифического антигена
в клетках прямой иммунофлуоресценцией.
     ЗЛ. Аппаратура, материалы и реактивы
     Термостат, обеспечивающий температуру нагрева 37 ‘С.
      Центрифуга лабораторная любого типа, обеспечивающая частоту' вращения 5000 м и н -1.
      Шкаф сушильный.
      Микроскоп биологический.
      Микроскоп люминесцентный.
     Холодильник бытовой.
      Мешанка магнитная.
      Пипетки градуированные вместимостью I. 2, 5 и 10 см3 п о ГОСТ 29227.
      Пробирки бактериологические.
      Камера Горяева.
     Стекла покровные по ГОСТ 6672.
     Стекла предметные по ГОСТ 9284.
      Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 см3 по ГОСТ 1770.
      Банка цилиндрическая по ГОСТ 25336.
     Ступка фарфоровая с пестиком.
     Чашки Карреля.
     Трубка силиконовая.
      Иглы типа «Рекорд» 1Л1-16-90-115.
     Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
     Трепановый синий, раствор с массовой долей 0,5 %.
     Монохлорамин Б технический по ГОСТ 14193, раствор с массовой долей 5 %.
      Гидролизат лактальбумина на растворе Эрла, раствор с массовой долей 0,1 % (ростовая среда):
готовят в соответствии с указаниями изготовителя.
      Пенициллин.
     Стрептомицин.
      Гепарин.
      Раствор фосфатный буферный pH 7.2—7,4; готовят по п. 2.2.1.
     Ацетон по ГОСТ 2603.
     ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС.
      Вода дистиллированная.
     3.2. Подготовка к анализу
     3.2.1. Приготовление культуры лейкоцитов крови
      Культуру лейкоцитов готовят из крови моровых поросят крупной белой породы живой массой
25—30 кг. Кровь берут в количестве 10—15 см3 из краниальной полой вены в стерильный цилиндр
вместимостью 50—100 см3, содержащий гепарин 10—20 ЕД/см3. выдерживают 40—60 мин при тем­
пературе 37 'С и отделяют верхний слой, состоящий из плазмы и лейкоцитов. Плазму с лейкоцитами
тщательно перемешивают и определяют концентрацию клеток.
      Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Для этого к пробе клеточной суспензии добавляют
равный объем раствора трепанового синего с массовой долей 0.5 %. Количество клеток определяют
по всему полю камеры, имеющей 25 больших и 100 малых квадратов. Число клеток умножают на
2200. Полученный результат соответствует количеству клеток в 1 см* суспензии.
     Для посева используют суспензию, содержащую 4—6 млн лейкоцитов в 1 см3. Для получения
средней посевной концентрации 5 млн/см3 к алазме с лейкоцитами добавляют необходимое количество
питательной среды pH 7,2—7,4 следующего состава: 0,1 % гидролизата лактальбумина на растворе Эрла,
пенициллин 100—200 ЕД/см3, стрептомицин 100—200 мг/см3, гепарин 10—20 ЕД/см3.
      Приготовленную суспензию клеток разливают по 9—10 см3 в чашки Карреля или по 2—3 см3
в пробирки с пластинками из покровных стекол, помещают в термостат при температуре 37 *С и
выдерживают в течение 2—3 сут.
     Для исследования используют культуру клеток с плотностью не менее 400—500 клеток в пале
зрения микроскопа (увеличение 10 х 10) с отчетливой ростовой активностью. Клетки должны быть
прозрачными, без зернистости, различной величины, без признаков дегенерации.