ГОСТ 28396-89

Группа С 19


                   М   Е   Ж     Г   О   С    У        Д    А   Р   С   Т    В   Е   Н   Н   Ы   Й   С Т А Н Д А Р Т


                                     ЗЕРНОВОЕ СЫРЬЕ, КОМБИКОРМА

                                             Метод определения патулина                                      ГОСТ
                                             Grain raw material, mixed fodders.
                                                                                                           28396-89
                                             Method for determination of patulin




                   О КСЛГУ 92%

                                                                                                         Д ата введения 01.07.90


                        Настоящий стандарт распространяется па фуражное зерно, продукты его переработки, ком­
                   бикорма и устанавливает метод определения патулина.
                        Сущность метода заключается в экстракции патулина из исследуемой пробы корма хлороформ —
                   метанолом, очистке экстракта колоночной хроматографией с последующим полуколичественным
                   определением его концентрации методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) путем визуального
                   сравнения пятен.
                        Минимальный уровень обнаружения патулина 10 нг.
                        Минимальный открываемый уровень метода 100 мкгкг-1 .
                        Изапечен не = 90 %.

                                                                        1.   ОТБОР ПРОБ

                        Отбор проб - по ГОСТ 12430. ГОСТ 13496.0 и ГОСТ 13586.3.

                                                  2.       АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
                        Аппликатор слоев.
                        Камера хроматографическая.
                        Микрошприцы вместимостью 10—50 мм3 с градуировкой I мм3.
                        Пластинки стеклянные размером 200 х 200 мм.
                        Пульверизатор для жидкостей.
                        Гомогенизатор (измельчитель лабораторный).
                        Сито, обеспечивающее получение фракции не более 2 мм.
                        Источник УФ-излучения с длиной волны 330—360 нм.
                        Аппарат для встряхивания.
                        Спектрофотометр, обеспечивающий измерение в области длин волн 250—400 нм.
                        Шкаф сушильный, обеспечивающий регулирование температуры до 150 “С.
                        Испаритель вакуумный роторного типа.
                        Весы технические с погрешностью взвешивания не более 100 мг.
                        Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 0,1 мг.
                        Воздухонагреватель (фен).
                        Пульверизатор для жидкости стеклянный.
                        Баня водяная, обеспечивающая регулирование температуры до 100 *С.
                        Насос водоструйный или другой вакуумный насос.
                        Колонка хроматографическая с краном, внутренним диаметром 20 мм и длиной 300 мм.
                        Стакан В -1-250 ТСХ по ГОСТ 25336.



                   Издание официальное                                                                  Перепечатка воспрещена




элементы кружева

ГОСТ 28396-89 С. 2

      Воронка Бюхнера диаметром 10 см с колбой для отсасывания по ГОСТ 9147.
      Колбы Эрленмейера с притертой пробкой КН-1—250—14/23 ТС по ГОСТ 25336 и
К Н -1-1000-14/23 ТС по ГОСТ 25336.
      Эксикатор 2 -2 9 0 по ГОСТ 25336.
      Воронки стеклянные 1 2 -3 6 -8 0 ХС и В-75-140 ХС по ГОСТ 25336.
      Колба мерная K I - 1 0 0 - 2 по ГОСТ 1770.
      Цилиндры 1-25, 50, 100 по ГОСТ 1770.
      Пипетки 2—1, 5, 10. 20 по нормативно-технической документации.
      Колба круглодонная с притертой пробкой К-1—250—29/32 ТС по ГОСТ 25336.
      Колба Бунзена вместимостью 500 см3.
      Колба остродонная с притертой пробкой 0—25—14/23 ТС по ГОСТ 25336.
      Фильтры бумажные диаметром 7 и 10 см. со средней скоростью пропускания.
      Вата стеклянная.
      Ангидрид уксусной кислоты по ГОСТ 5815.
      Ацетон по ГОСТ 2603.
      Кислота муравьиная по ГОСТ 5848 с массовой долей 85—90 %.
      Бензол по ГОСТ 5955.
      Хлороформ по ГОСТ 20015.
      о-Дианизидин, раствор; готовят следующим образом: растворяют 0.2 г о-дианизидина в 5 см3
муравьиной кислоты.
      Эфир диэтиловый.
      Эфир уксусноэтиловый.
      Спирт этиловый по ГОСТ 5962.
      Калия перманганат по ГОСТ 20490, раствор с массовой долей 1,5 %; готовят следующим
образом: 1.5 г КМ п04 растворяют в воде и доводят объем до НЮ см3.
      Силикагель для колоночной хроматографии, готовят следующим образом: 80 г силикагеля 60
с размером частиц от 0.63 до 0,20 мм сушат в течение 1 ч при 105 *С. после остывания смешивают
с 20 см3 воды и встряхивают в закрытом сосуде в течение 2 ч.
      Силикагель для тонкослойной хроматографии, пластинки «Силуфол».
      Метанол по ГОСТ 6995.
      Натрия сульфат безводный по ГОСТ 4166.
      Пиридин по ГОСТ 13647.
      Кислота соляная по ГОСТ 857, раствор с массовой долей К) %.
      Толуол по ГОСТ 5789.
     Детергента раствор.
      «-гексан.
      Осушитель для эксикатора, нейтральный, например синий гель.
      Патулин, аназитический стандарт.
      Азот или другой инертный газ.


                               3.   ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

     3.1. П р и г о т о в л е н и е х р о м а т о г р а ф и ч е с к о й к о л о н к и
     В хроматографическую колонку на пористое стеклянное дно или стеклянную вату вносят 15 г
силикагеля со смесью бензол-уксусный эфир в соотношении 3:1 по объему. После оседания
силикагеля излишку растворителя дают стечь, следя за тем, чтобы поверхность стационарной фазы
оставалась покрытой растворителем.
     3.2. П о д г о т о в к а п л а с т и н о к д л я т о н к о с л о й н о й х р о м а т о г р а ф и и
     Тщательно моют пластинки детергентом, обмывают последовательно проточной водой, затем
дистиллированной водой и этанолом и сушат на воздухе. С помощью аппликатора наносят на
пластинки равномерным слоем суспензию силикагеля в воде из расчета 35 г силикагеля в 70 см3
воды для 5 пластинок. Толщина слоя должна быть 0,5 мм. После воздушной сушки пластинки
активируют в сушильном шкафу при 110 *С в течение 1 ч и хранят в эксикаторе над нейтральным
осушителем.

С. 3 ГОСТ 28396-89

      3.3. П р и г о т о в л е н и е   растворителей    для   тонкослойной     хроматогра-
фии
     Для проведения анализа готовят системы растворителей следующего состава:
     I. Толуол — уксусноэтиловый эфир-муравьиная кислота в объемных соотношениях 50:40:10.
     И. Хлороформ-ацетон в объемных соотношениях 90:10.
      III. Хлороформ-гексан-ацетон в объемных соотношениях 71:16:13.
     IV. Бензол-метанол-уксусноэтиловый эфир в объемных соотношениях 96:4:1.
     V. Эфир диэтиловый.
     3.4. П о д г о т о в к а х р о м а т о г р а ф и ч е с к о й к а м е р ы
      В хроматографическую камеру вносят систему растворителя по п. 3.3. Толщина слоя прибли­
зительно 8 мм. Заднюю стенку хроматографической камеры облицовывают фильтровальной бума­
гой, пропитанной растворителем.
     3.5. П р и г о т о в л е н и е к а м е р ы д л я х л о р и р о в а н и я
      В хроматографическую камеру вносят 25 см3 соляной кислоты и 25 см5 раствора перманганата
калия и смешивают.
      При этом крышка должна быть закрытой. Кроме того, в камеру ставят стеклянный предмет
(например чашку Петри) для того, чтобы имелась повышенная площадка, на которую можно
помещать ТСХ-пластинку, не погружая ее в жидкость. Камеру готовят непосредственно перед
проведением испытания.
     3.6. П р и г о т о в л е н и е с т а н д а р т н о г о р а с т в о р а п а т у л и н а
     Рабочий стандартный раствор патулина готовят из основного раствора. Основной раствор,
содержащий 10 мкг/см3 патулина, готовят следующим образом: 1,0 мг патулина растворяют хлоро­
формом и доводят объем до 100.0 см3.
      Концентрацию патулина в основном растворе контролируют при помощи спектрофотометра.
Дая этого 5,0 см* основного раствора выпаривают досуха в вакуумном испарителе под азотом при
30—35 *С, сразу растворяют остаток в 5.0 см' этанола и измеряют поглощение основного раствора
и этанола с толщиной поглощающего свет слоя 0,5 см при длине волны 275 нм.
      Концентрацию патулина (О , мкг/см3, вычисляют по формуле

                                               A M 1000 *
                                                  t-D

где А — поглощение раствора патулина на длине волны 275 нм;
   А/— молярная масса патулина, г/моль, равная 154;
    К — калибровочный коэффициент спектрофотометра: от 0,95 до 1.05;
    £ — молярный коэффициент поглощения патулина при дзине волны 275 нм, равный 14600;
    D — длина оптического нуги, см.
      Стандартный раствор, содержащий 2 мкг/см' патулина. готовят следующим образом: 20,0 см*
основного раствора разбавляют хюроформом до 100.0 см3.
      Основной и стандартный растворы патулина хранят в темной посуде при 4 *С.
      3.7. П о д г о т о в к а п р о б
      Исследуемый образец корма измельчают, тщательно перемешивают и пропускают через
сито.

                                       4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ

     4.1. П о л у ч е н и е э к с т р а к т а
     10,0 г подготовленной пробы переносят в колбу Эрленмейера вместимостью 250 см-, добав­
ляют 80 см3 хлороформа и 10 см3 метанола, закрывают колбу и встряхивают при комнатной
температуре в аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Полученный экстракт фильтруют через
воронку Бюхнера, остазок трижды промывают порциями по 25 см3 хлороформа. Объединенные
хлороформные экстракты смешивают с безводным сульфатом натрия в количестве около 15 г и
оставляют в закрытой колбе на I ч, периодически встряхивая. Затем сульфат натрия отделяют через
складчатый фильтр и, во избежание потерь экстракта, сульфат натрия промывают дважды порциями
по 10 см3 хлороформа. Затем в круглодонной колбе в вакуумном испарителе экстракт выпаривают
досуха при 40 "С.

ГОСТ 28396-89 С. 4

     Если в экстракте содержатся незначительные количества примесей, то остаток растворяют в
1 см3 хлороформа и непосредственно проводят тонкослойно-хроматографические определения.
При наличии больших количеств примесей проводят очистку экстракта колоночной хроматогра­
фией.
     4.2. О ч и с т к а э к с т р а к т а
      Концентрированный экстракт сразу же растворяют в 10 см3 смеси бензола и уксусноэтилового
эфира в объемном соотношении 3:1. Полученный раствор вносят в хроматографическую колонку
с силикагелем. Необходимая скорость прохождения экстракта по колонке обеспечивается при
скорости отекания, равной четырем каплям в секунду. Затем через слой силикагеля, едва покрытый
жидкостью, с такой же скоростью пропускают последовательно порциями 300 см3 смеси бензола с
уксусноэтиловым эфиром в соотношении 3:1. Первые 50 см3 смеси после выхода из колонки
отбрасывают. Последующие 250 см3 смеси, содержащей патулин, собирают и выпаривают в остро­
донной колбе при 40 *С в вакуумном испарителе.
     4.3. О б н а р у ж е н и е п а т у л и н а с п о м о щ ь ю т о н к о с л о й н о й х р о м а т о г р а -
фии
     4.3.1. К выпаренному досуха экстракту добавляют сразу 1 см3 хлороформа.
     На пластинку для ТСХ наносят на расстоянии 1,5 см от нижнего края и 1,5 см от бокового
края один раз 5 мм3 и дважды по 10 мм3 экстракта и по 5, 10. 30 и 50 мм3 стандартного раствора
патулина, что соответствует 10, 20, 40. 60 и 100 нг патулнна. На одно пятно, содержащее 10 мм'
экстракта, дополнительно наносят 20 мм3 стандартного раствора (внутренний стандарт).
     Пластинку помешают в хроматографическую камеру с системой I и проявляют до подъема
системы на 10 см от линии старта. Затем пластинку извлекают из камеры и сушат при комнатной
температуре.
     4.3.2. Высушенную пластинку помешают на 5 мин в камеру для хлорирования, затем на 5 мин
в вытяжной шкаф для того, чтобы испарился хлор, и опрыскивают из пульверизатора раствором
о-дианизидина. Через 15 мин проводят детекцию в Уф-свете под фильтром. Патулин выявляется
на хроматограмме в виде желто-зеленого флюоресцирующего пятна, при этом значение фактора
удержания равно 0.5 при использовании растворителя I.
     Если в области R f патулина появляются нежелательные пятна, покрывающие патулин. то их
отделяют, используя систему растворителя II или проводя двухмерную хроматографию по п. 4.4.1.
     4.4. П о д т в е р ж д е н и е н а л и ч и я п а т у л и н а
      В случае обнаружения на хроматограмме желто-зеленых флюоресцирующих пятен, имеющих
то же значение Rf. что и стандартный раствор, а следовательно, свидетельствующих о наличии
патулина, полученный результат подтверждают проведением двумерной хроматографии и (или)
образованием производных. Такое подтверждение необходимо в связи с тем. что различные
содержащиеся в растениях соединения, например гидрометилфурфурол, ведут себя подобно пату-
лину. Если желто-зеленые пятна на хроматограмме исчезают быстрее, чем стандартный раствор, то
это указывает на вероятность отсутствия в исследуемом материале патулина.
     4.4.1. Подтверждение наличия патулина с помощью двухмерной тонкослойной хроматогра(1>ии
     На точку А (см. чертеж) обеих пластинок помешают от 5 до 10 мм3 исследуемого экстракта.
Объем зависит от концентрации патулина. а также от
содержания нежелательных примесей в экстракте.
     Кроме того, на точку С пластинки наносят 10 мм3,
на точки Du В — 20 мм3, на точку Е — 30 мм3 и на точку
Л — 50 мм3 стандартного раствора.
     На вторую пластинку наносят одинаковые объе­
мы экстракта и стандартного раствора, как описано
для первой пластинки. В отличие от первой пластин­
ки на точку Л второй пластинки дополнительно на­
носят 20 мм3 стандартного раствора (внутренний
стандарт).
     Точка Л — стартовая точка экстракта; точки В — F
— стартовые точки стандартного раствора патулина.
     Пластинки проявляют в первом направлении дви­                •А
жения с помощью растворителя I (Rf патулина 0,5). а
после высушивания во втором направлении с помощью                    Направление дбижения
растворителя III (R/ патулина 0,2).                                  второго растворителя