ГОСТ 28001-88

Группа С19


                                 М   Е   Ж    Г        О   С   У   Д   А   Р   С   Т   В   Е    Н   Н      Ы   Й   С Т А Н Д А Р Т


                                                   ЗЕРНО ФУРАЖНОЕ, ПРОДУКТЫ ЕГО
                                                     11ЕРЕ РАБОТКИ, КОМ БИ КОРМА

                                                    Методы определения микогоксинов:
                                                                                                                           ГО С Т
                                              Т-2 токсина, зеаралеиона (Ф -2) и охра токсина А                           28001-88

                                                  Fodder grain, products of its processing, mixed feeds.
                                                       Methods for determination of micotoxins:
                                                     T-2 toxin, zcaralcnon (F-2) and ochratoxin A
                                 ОКСТУ 9209

                                                                                                                       Дата введения 01.01.90


                                      Настоящий стандарт распространяется на фуражное зерно, продукты его переработки и все
                                 виды комбикормов и устанавливает методы определения токсинов Т-2, зеаралепона (Ф-2) и
                                 охратоксина А.
                                      Стандарт применяют в ветеринарных лабораториях Госагропрома СССР.

                                                                                   1. ОТБОР ПРОБ
                                      Отбор проб - по ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13496.0, ГОСТ 20239, ГОСТ 12430.

                                                  2.       МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ФУРАЖНОМ ЗЕРНЕ

                                       Сущность метода заключается в извлечении токсина ацетоном, очистке экстракта от липидов
                                 и растительных пигментов с последующей доочисткой на хроматографической колонке и двукрат­
                                 ном хроматографировании его на пластинке «Силуфол» со стандартным раствором токсина.
                                 Чувствительность метода — 600 мкг/кг кормового средства.
                                       2.1. Аппаратура, материалы и реактивы
                                       Шуттель-аппарат.
                                        Баня водяная, электрическая (2—4-гнездная).
                                        Весы аналитические марки АДВ-200.
                                       Весы лабораторные 2-го класса точности по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания
                                 200 г.
                                        Мельница лабораторная электрическая.
                                       Источник ультрафиолетовых лучей с длиной волны 365 нм марки ОИ-18, ВИО-1 или других
                                 аналогичных марок.
                                       Микрошприц вместимостью 0,01 см3.
                                       Шкаф сушильный.
                                       Набор сит.
                                       Испаритель роторный.
                                       Распылитель стеклянный (пульверизатор).
                                       Холодильник.
                                       Электрофен бытовой по ГОСТ 22314.
                                        Мельница шаровая.
                                       Эксикатор диаметром 29 см.
                                        Штатив Бунзена.
                                       Штатив для пробирок.




                                 Издание официальное                                                                  Перепечагка воспрещена
                                                                                           69




кружевные перчатки без пальцев

С. 2 ГОСТ 2800 1 -8 8                                                              Электронная версия

     Пробирки стеклянные мерные с притертой пробкой вместимостью 5 и 10 см' по ГОСТ 1770.
     Пробирки центрифужные вместимостью 10 см3.
     Воронки стеклянные диаметром 4. 6, 8 см по ГОСТ 25336.
     Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 500 и 250 см3.
     Колбы мерные исполнений I и 2 вместимостью 25, 50. 100 см3 2-го класса точности по
ГОСТ 1770.
     Воронки делительные типа ВД, исполнений 1—3, вместимостью 500 см3 по ГОСТ 25336.
     Пипетки градуированные исполнений 1. 2 . 4 . 5 вместимостью 1. 2 и 10 см3 2-го класса точности
по нормативно-технической документации.
     Цилиндры мерные вместимостью 25. 50 и 100 см3 по ГОСТ 1770.
     Чашки фарфоровые диаметром 15 см по ГОСТ 9147.
     Колонка хроматографическая диаметром 1.8 см, высотой 18—20 см.
     Пластинки хроматографические «Силуфол» с флюоресцентным слоем марки ИУ-254. разме­
ром 15 х 15 см.
     Камера хроматографическая.
     Бумага лабораторная фильтровальная по ГОСТ 7584.
     Алюминия окись для хроматографии, 2-й степени активности по Брокману, ч.
     Ацетон по ГОСТ 2603, ч. д. а.
     Гексан, х. ч.
     Кальция окись по ГОСТ 8677, х. ч.
     Кальций хлористый плааленый. ч.
     Кислота азотная по ГОСТ 4461. х. ч.
     Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, х. ч.
     Кислота уксусная, ледяная по ГОСТ 61, х. ч.
     Кислота серная по ГОСТ 4204. х. ч.
     Серебро азотно-кислое по ГОСТ 1277, ч. д. а.
     Силикагель марки КСК.
     Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
     Толуол по ГОСТ 5789. ч. д. а.
     Хлороформ для наркоза по ГОСТ 20015.
     Этилацетат по ГОСТ 22300. ч.
     Стандарт микотоксина Т-2.
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     П р и м е ч а н и е . Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства
измерений, имеющие аналогичные метрологические характеристики.
      2.2. Подготовка к испытанию
      2.2.1. П о д г о т о в к а п р о б к и с п ы т а н и ю
      Из средней пробы фуражного зерна методом квартования выделяют часть пробы массой не
менее 100 г. которую размалывают на электромельннце до такого состояния, чтобы она проходила
без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Подготовленную для испытания пробу хранят
в стеклянной колбе с крышкой в сухом темном месте.
      2.2.2. П о д г о т о в к а х р о м а т о г р а ф и ч е с к о й к о л о н к и
      Хроматографическую колонку заполняют в следующей последовательности: вначале помеща­
ют тампон гигроскопической ваты, затем I г силикагеля. 2 г окиси алюминия и 2 г окиси кальция.
Силикагель и окись алюминия вносят небольшими порциями, слегка постукивая по колонке. Для
удаления пузырьков воздуха промывают колонку небольшим количеством хлороформа (15—20 см)
при отсасывании водоструйным насосом. Окись кальция вносят в колонку в виде хлороформной
суспензии при отсасывании водоструйным насосом.
      2.2.3. П р и г о т о в л е н и е р а с т в о р о в и р е а к т и в о в
      2.2.3.1. Приготовление 20 %-ного спиртового раствора серной кислоты
      11,5         см3 серной кислоты небольшими порциями, при осторожном перемешивании, переносят
в мерную колбу вместимостью 100 см3 с небольшим количеством этилового спирта (15—20 см).
После охлаждения раствора постепенно, при постоянном перемешивании, добааляют в колбу
этиловый спирт до метки. Охлаждают при комнатной температуре и окончательно ловолят раствор
в колбе спиртом до метки.
                                                   70

Электронная версия                                                       ГОСТ 2 8 0 0 1 -8 8 С. 3

      2.2.3.2. Приготовление системы растворителей
      Растворитель 1. Гексан смешивают с этнлацетатом и соотношении 1:1. Высота слоя налитой
в хроматографическую камеру жидкости не должна превышать 0,5 см;
      Растворитель 2. Толуол смешивают с этнлацетатом и муравьиной кислотой в соотношении
6:3:1 или хлороформ смешивают с этнлацетатом и уксусной ледяной кислотой в соотношении
17:3:1.
      2.2.3.3. Приготовление водного раствора азотмо-кислого серебра с массовой долей 2 %
      1 г азотно-кислого серебра помешают в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют
дистиллированную воду до метки. Раствор хранят в холодильнике.
      2.2.3.4. Приготовление силикагеля
      Силикагель размалывают на шаровой мельнице и заливают на 18—20 ч соляной кислотой,
разбавленной водой 1:1. Затем кислоту сливают и силикагель промывают водой до отсутствия в
промывных водах следов иона хлора. Для этого к 1 см3 промывных вод прибавляют I см3
раствора азотно-кислого серебра с массовой долей 2 % и I см' азотной кислоты. В присутствии
иона хлора выпадает осадок белого цвета. Затем силикагель промывают ацетоном, просушивают
под тягой до исчезновения запаха ацетона и высушивают в сушильном шкафу при температуре
130 “С в течение 4—6 ч. Очищенный и высушенный силикагель просеивают через сито. Для
заполнения хроматографической колонки используют фракцию, проходящую через сито с
размером отверстий 0,105 мм и задерживающуюся на сите — 0.075 мм. Силикагель хранят в
плотно закрытых сосудах.
      2.2.3.5. Подготовка окиси кальция, силикагеля и шастинки «Смуфол»
      Окись кальция, силикагель и пластинки «Силуфол* перед использованием активируют нагре­
ванием в сушильном шкафу при температуре 100 *С в течение 1 ч. Окись кальция предварительно
растирают в фарфоровой ступке.
      2.2.3.6. Приготовление стандартного раствора микотоксина Т-2
      Взвешивают в стаканчике вместимостью 25 см3 0,0250 г (точная навеска) кристаллического
микотоксина Т-2, переносят с помощью этилового спирта или ацетона в мерную колбу вместимос­
тью 50 см3 и доводят объем раствора спиртом или ацетоном до метки. В 1 см3 раствора содержится
0,5 мг Т-2 токсина. Раствор устойчив в течение 3 мес при хранении на холоде.
      2.3. Проведение испытания
      2.3.1. Из подготовленной для испытания пробы зерна отбирают навеску массой 25 г и
помещают в колбу вместимостью 500 см ’. В колбу вносят 150 см3 ацетона и встряхивают па
шуттель-аппарате 1,5 ч (либо оставляют на 18—20 ч при комнатной температуре). Экстракт
фильтруют через бумажный фильтр в колбу, а остаток корма еще раз заливают 100 см3 ацетона,
вновь встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр в соответствующую колбу. Фильтр
промывают К) см3 ацетона, присоединяя фильтрат к общему ацетоновому экстракту, который
переносят в делительную воронку. К ацетоновому экстракту добавляют 25 см3 гексана, переме­
шивают и добавляют 50 см3 воды. После разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой)
удаляют, а нижний слой (водно-ацетоновая фракция) повторно экстрагируют 25 см3 гексана при
перемешивании растворов. Выделившийся после отстаивания смеси верхний гексановый слой
снова удаляют.
      2.3.2. Водно-ацетоновую фракцию экстрагируют 25 см3 хлороформа. Содержимое перемеши­
вают 2 мин и оставляют для разделения слоев. После разделения слоев хлороформную фракцию
(нижний слой) собирают в отдельную колбу, а затем пропускают через подготовленную хромато­
графическую колонку. Очищенный на колонке от примесей экстракт собирают в колбу дтя отгона
или выпарительную чашку. Экстракцию водно-ацетоновой фракции хлороформом проводят еще
два раза, экстрагируя каждый раз 20 см3 хлороформа и пропуская каждую порцию экстракта через
хроматографическую колонку. Экстракты, очищенные на колонке, собирают вместе в колбе дтя
отгона или выпарительной чашке. Затем колонку три раза промывают хлороформом по 30 см3 с
последующим присоединением промывных порций к основному экстракту, находящемуся в колбе
дтя оттона.
      2.3.3. Колбу дтя отгона соединяют с перегонным аппаратом или роторным испарителем и
содержимое ее концентрируют на кипящей водяной бане до 3 см3. При использовании выпари­
тельной чашки раствор упаривают также на кипящей водяной бане до 2—3 см3. Концентриро­
ванный хлороформный экстракт переносят в центрифужную пробирку. Колбу трехкратно
ополаскивают 1— 1.5 см3 хлороформа, присоединяя эти порции к основному раствору в пробир­
ке. Пробирку нагревают на водяной бане до полного удаления хлороформа. Нагревание ведут
                                              71

С. 4 ГОСТ 2800 1 -8 8                                                       Электронная версия

вначале при температуре 80—85 “С. а татем по мере уменьшения объема раствора температуру
снижают до 60 *С.
      2.3.4. Остаток в пробирке растворяют в 0,1 см3 ацетона и наносят микрошприцем на стартовую
линию хроматографической пластинки «Силуфол*. Пробы наносят по 0,01 см’ на расстоянии 1,5 см
друг от друга и нижнего края пластинки. Одновременно с исследуемыми растворами на пластинку
наносят 0.002 см5 стандартного спиртового или ацетонового раствора токсина Т-2. Пластинку с
нанесенными пробами помещают в насыщенную парами растворителей хроматографическую
камеру таким образом, чтобы стартовая линия располагалась на 0,5 см выше уровня подвижного
растворителя. Первое хроматографирование проводят в системе этилацетат — гексан (1:1). Когда
фронт растворителя продвинется на высоту 14,5 см от нижнего края пластинки, хроматограмму
извлекают из камеры. 5—7 мин подсушивают на воздухе, а затем 1—2 мин в сушильном шкафу при
температуре 100 "С. После высушивания хроматограмму повторно помещают в камеру с системой
растворителей хлороформ — этилацетат — уксусная кислота (17:3:1) или толуол — этилацетат —
муравьиная кислота (6:3:1).Когда фронт смеси растворителей продвинется на высоту 14,5 см.
хроматограмму извлекают из камеры, подсушивают на воздухе, обрабатывают 20 %-ным спиртовым
раствором серной кислоты из пульверизатора и помешают в сушильный шкаф с температурой
110 "С. Пластинку выдерживают в сушильном шкафу 3—5 мин до небольшого потемнения. После
этого пластинку' извлекают из шкафа, охлаждают и просматривают в ультрафиолетовых лучах
длиной 365 нм.
      2.4. Обработка результатов
      Токсин Т-2 на хроматограмме в исследуемой пробе обнаруживают в виде пятна с голубой
флюоресценцией, соответствующей по положению и флюоресценции пятну токсина Т-2 в стан­
дартной пробе. При использовании в повторном хроматографировании системы толуол — этилаце­
тат — муравьиная кислота (6:3:1) R] Токсина Т-2 составляет 0,23—0.24. при применении системы
хлороформ — этилацетат — уксусная кислота (17:3:1) — 0,20—0,23.
      Результат считается положительным на наличие токсина Т-2 при обнаружении голубой
флюоресценции на пластинке «Силуфол* в исследуемой пробе, соответствующей по положению
флюоресценции пятну стандартного раствора Т-2 токсина хотя бы в одной из двух параллельных
проб.


              3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА (Ф -2)
                 В ФУРАЖНОМ ЗЕРНЕ, ПРОДУКТАХ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ
                               И КОМБИКОРМАХ

      Сущность метода заключается в экстракции зеараленона (Ф-2) из кормов смесью ацетонитрила
и раствора хлористого калия, его очистке и хроматографировании на пластинках «Силуфол» с
последующим измерением интенсивности флюоресценции или интенсивности его окрашивания
красным прочным ЖЖ в сравнении со стандартным раствором зеараленона. Чувствительность
метода 50 мкг/кг кормового средства.
      3.1. Аппаратура, материалы и реактивы
      Мельница лабораторная электрическая.
       Весы лабораторные 2-го класса точности по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания
200 г.
      Весы аналитические марки АДВ-200.
       Насос водоструйный.
      Испаритель роторный.
       Баня водяная электрическая (2—4-гнездная).
       Источник ультрафиолетовых лучей длиной волны 253 нм марки ВИО-1, или других аналогич­
ных марок или хроматоскоп.
       Шутгель-аппарат.
       Набор сит.
      Микрошприц вместимостью 0,01 см3.
      Распылитель стеклянный (пульверизатор).
       Шкаф сушильный.
      Электрофен бытовой ГОСТ 22314.
      Холодильник.
       Штатив Бунзена.
                                               72