ГОСТ 25587-83

УДК 636: 576.8.07 :006.354                                        Группа С19

               Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й        С Т А Н Д А Р Т     С О Ю З А     ССР



                          ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
                                                                            ГОСТ
                          Методы лабораторной диагностики
                                болезни Ньюкасла                       2 5 5 8 7 -8 3
                                Agricultural poultry.
                         . Methods of laboratory diagnostics           JCT СЭВ 1742—79)
                                of Newcastle disease



               Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 января
               1983 г. № 97 срок действия установлен
                                                                              с 01.07.83
                                                                             до 01.07.83

                               Несоблюдение стандарта преследуется по закону


                  Настоящий стандарт распространяется на кур, индеек, фаза­
               нов, цесарок и устанавливает методы лабораторной диагностики
               болезни Ньюкасла.
                  Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы
               в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреж­
               дений.
                  Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1742—79.
                                            1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

                  1.1. Для выделения вируса от больной или павшей в первые
               10—12 ч птицы берут головной мозг, трахею, легкие, селезенку,
               печень, почки. .
                  Пробы патологического материала берут с соблюдением пра­
               вил асептики в стерильную стеклянную посуду с 50%-ным раство­
               ром глицерина на дистиллированной ’воде.
                  1.2. Для определения антител в сыворотке крови берут сте­
               рильно в пробирки, увлажненные физиологическим раствором,
               пробы крови из подкрыльцовой вены птиц. Полученную кровь вы­
               держивают до образования сгустка при комнатной температуре
               или в термостате при 37°С в течение 1—2 ч, затем осторожно об­
               водят иглой или пастеровской пипеткой и оставляют на 16 ч в ре­
               фрижераторе при температуре 2—4°С.
                  Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасы­
               вают пипеткой в стерильные пробирки.

               Издание официальное                                    Перепечатка воспрещена
                                                                                        31

купить жакет

Стр. 2 ГОСТ 25587— 83


   С целью ретроспективной диагностики пробы крови берут
через 12—14 сут после первых признаков клинического проявле­
ния болезни.
   1.3. Сыворотку исследуют в течение 3 сут с момента взятия.
В случае длительного хранения в сыворотку добавляют мертиолат
натрия в концентрации 1 :10000.
   1.4. Пробы патологического материала и сывороток крови
доставляют в лабораторию в термосе со льдом с сопроводительным
документом, содержащим данные о клинике, эпизоотологии забо­
левания и вскрытии трупов.
   1.5. До начала лабораторного исследования патологический
материал и сыворотки крови хранят в рефрижераторе при темпе­
ратуре 2—4°С.
                        2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

    2.1. М е т о д в ы д е л е н и я в и р у с а
    Сущность метода заключается в выявлении патогенного дейст­
вия вируса на эмбрионы кур, его гемагглютинирующих свойств с
последующей идентификацией серологическим методом, опреде­
лении титра и вирулентности выделенного вируса.
    2.1.1. Аппаратура, реактивы и материалы
    Для проведения исследования применяют:
    термостат с температурой нагрева 37—38°С;
    центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000 об/мин;
    стаканы центрифужные вместимостью 50 и 100 см3;
    весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более
0,01 г;
    размельчитель тканей;
    овоскоп;
    колбы конические стеклянные вместимостью 100 см3 по ГОСТ
1770—74;
   пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ
25336—82;
    пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные
вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292—74;
    ступку фарфоровую;
    шприцы с иглами;
    стекло кварцевое;
    натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,87%-ный раствор (фи­
зиологический) с pH 7,2—7,4;
    натрия гидроокись по ГОСТ 4328—77, 3%-ный раствор или
другие дезинфицирующие растворы;
    натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280—76, трехзамещенный,
5%-ный раствор;
    йод по ГОСТ 4159—79, 5%-ный раствор;
 32

ГОСТ 25587— 83 Стр. 3


    антибиотики (пенициллин, стрептомицин, неовитин);
    парафин по ГОСТ 23683—79;
    развивающиеся эмбрионы кур 9—10-суточного возраста;
    эритроциты кур в физиологическом растворе, 1%-ная взвесь;
готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в
возрасте старше 6 мес из покрыльцовой вены в колбу с физиоло­
гическим раствором лимоннокислого натрия. Полученную кровь
отмывают физиологическим раствором, осаждая центрифугирова­
нием с частотой вращения 1500 об/мин в течение 10 мин. Из осад­
ка отмытых эритроцитов готовят 1%-ную суспензию на физиоло­
гическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 С.
    2.1.2. Подготовка к исследованию
    Пробы патологического материала стерильно извлекают из
глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным
физиологическим раствором и гомогенизируют в стерильном фи­
зиологическом растворе в соотношении 1 :5 с помощью размель-
чителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом,
центрифугируют с частотой вращения 1500—2000 об/мин в тече­
ние 20 мин.
    Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и обрабатыва­
ют в течение 30 мин при комнатной температуре антибиотиками:
 1000—2000 ЕД/см3 пенициллина и 500—1000 ЕД/см3 стрептоми­
цина для подавления посторонней микрофлоры.
     2.1.3. Проведение исследования
     Надосадочную жидкость исследуют в капельной реакции ге-
магглютинации с 1%-ной суспензией эритроцитов кур.
    Для исследования одной пробы материала заражают не ме­
нее 10 эмбрионов 9—10-суточного возраста. Контролем служат
3—5 незараженных эмбрионов.
     Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют,
отмечая границу пуги. Сбоку эмбриона между кровеносными со­
судами отмечают участок для прокола скорлупы и инокуляции
 испытуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место про­
 кола дезинфицируют и обрабатывают фламбированием. В центре
 воздушного пространства и в месте введения материала делают
 пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят
 0,2 см3 испытуемого материала на глубину 2—3 мм в аллантоис­
 ную полость. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе
 заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы ин­
 кубируют в термостате в течение 120 ч при температуре 37°С.
     В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сут­
 ки через 12 ч. Эмбрионы, погибшие в течение первых 24 ч, уни­
 чтожают, остальные сохраняют в холодильнике при температу­
 ре 4°С.
                                                            33

Стр. 4 ГОСТ 25587— 83


    Через 72 ч инкубации пять эмбрионов охлаждают при темпе­
ратуре 4°С в течение 12—18 ч, остальные пять инкубируют до
 120 ч, а затем охлаждают при 4°С в течение 16—18 ч.
    Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным прост­
ранством дезинфицируют 5%-ным раствором йода или фламби-
руют, вскрывают и собирают экстраэмбриональную (аллантоис­
но-амниотическую) жидкость в стерильные пробирки от каждого
эмбриона отдельно. Велогенные штаммы вируса убивают куриные
эмбрионы через 32—60 ч инкубации, мезогенные — через 60—90 ч,
лентогенные — через 100 ч и более.
    Взятые из каждого эмбриона образцы экстраэмбриональной
жидкости проверяют на гемагглютинирующую активность вируса
в капельной реакции гемагглютинации (РГА), которую ставят
на стекле путем смешивания капли экстраэмбриональной жид­
кости с каплей 1%-ной взвеси эритроцитов кур.
    При отсутствии РГА экстраэмбриональную жидкость, взятую
в количестве 1 см3 от каждого зараженного эмбриона (не ме­
нее 5), соединяют и повторно заражают развивающиеся куриные
эмбрионы 9—10-суточного возраста (не менее 10 эмбрионов).
    Выделение вируса проводят в течение 3—5 пассажей на кури­
ных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональ­
ную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА.
Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2—3 допол­
нительных пассажа.
    2.1.4. Обработка результатов
    Пробу испытуемого материала считают отрицательной, если
во всех проведенных пассажах не будут обнаружены гемагглюти-
нация эритроцитов и патогенное действие вируса (гибель эм­
брионов).
    При наличии гемагглютинации эритроцитов или гибели эм­
брионов проводят идентификацию выделенного вируса, определя­
ют титр и вирулентность вируса на эмбрионах кур.
    2.2.    Ме т о д п о с т а н о в к и р е а к ц и и г е м а г г л ю т и н а ­
ции
    Сущность метода заключается в способности вируса болезни
Ньюкасла агглютинировать эритроциты кур.
    2.2.1. Аппаратура,, материалы и реактивы
    Для проведения исследования применяют аппаратуру, мате­
риалы и реактивы, указанные в п. 2.1.1 и дополнительно:
    микротитратор Такачи;
    доски из плексигласа.
    2.2.2. Проведение исследования
    Готовят двукратные .разведения вируссодержащего материа­
ла от 1 :2 до 1 : 1024. Для этого в ряд лунок планшетки из плек­
сигласа (или пробирок) наливают физиологический раствор в
 34