ГОСТ 25583-83

УДК 636 : 576.8.07 : 006.354                                         Группа С79

                         Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й             С Т А Н Д А Р Т   С О Ю З А    ССР



                                     ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
                                     Методы лабораторной диагностики
                                                                                         ГОСТ
                                         инфекционного бронхита                      2 55 83-83
                                           A gricultural poultry.
                                     M ethods of lab o rato ry d iagnostics
                                          of infectious bronchitis                   |CT СЭВ 1744— 79)



                         Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 6 января
                         1983 г. № 18 срок действия установлен
                                                                                        с 01.07.83
                                                                                      до 01.07.88

                                          Несоблюдение стандарта преследуется по закону

                            Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавли­
                         вает методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита.
                            Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы
                         в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреж­
                         дений.
                            Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1744—79.

                                                         1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

                            1.1. Для вирусологического исследования берут пробы тканей
                         и органов — трахеи, слизистой оболочки носовой полости, почек и
                         легких убитой или только что павшей птицы, а от взрослой пти­
                         цы — почек и яйцеводов.
                             1.2. Для серологического исследования берут не менее чем от
                         10 голов птицы дважды с интервалом 14—21 сут пробы крови по
                         5 см3 от каждой птицы. Отстаивают сыворотку крови.
                            1.3. Пробы органов и тканей или их 10%-ную суспензию хра­
                         нят при температуре минус 20°С. Пробы сыворотки крови хранят
                         без добавления консервантов при температуре минус 20°С.

                                                        2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

                            2.1. В и р у с о л о г и ч е с к и й м е т о д
                            Сущность метода заключается в изолировании и идентифика­
                         ции возбудителя заболевания на куриных эмбрионах или на куль­
                         туре клеток.
                         Издание официальное
                          16
стоимость сертификации

ГОСТ 25583— 83 Стр. 2

    2.1.1. Аппаратура и материалы
    Для проведения исследования применяют:
    термостат с температурой нагрева 37—38СС;
    инкубатор;
    ступки фарфоровые;
    центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин;
    пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ
 10515—75;
    овоскоп;
    шприцы с иглами;
    куриные эмбрионы 9-суточного возраста;
    культуру клеток почек куриных эмбрионов или фибробласты;
    раствор Хенкса;
    стрептомицин, пенициллин.
    2.1.2. Подготовка к исследованию
    Пробы органов и тканей растирают в стерильной ступке в изо­
тоническом буферном растворе в соотношении 1: 10 и экстраги­
руют в течение 2 ч при 4°С. Суспензию центрифугируют с частотой
 вращения от 1500 до 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную
жидкость обрабатывают 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 ЕД/см3
стрептомицина.
    2.1.3. Проведение исследования
    Обработанную антибиотиками надосадочную жидкость иноку-
лируют в дозе 0,2 см3 через воздушную камеру в аллантоисную
полость шести куриным эмбрионам 9-суточного возраста.
    Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5°С и относительной
влажности 60—70% и два раза в день овоскопируют. Эмбрионы,
погибшие в течение 24 ч после заражения, не учитывают. Остав­
шихся в течение 72 ч трех живых эмбрионов убивают охлаждением
при температуре 4°С, а остальных собирают и охлаждают через
7 сут после заражения.. От первых трех эмбрионов собирают ал­
лантоисную жидкость и хориоаллантоисную оболочку для следую­
щего пассажа, а остальные эмбрионы исследуют на наличие ма­
кроскопических изменений.
    Проводят четыре последовательных пассажа вируса на кури­
ных эмбрионах, так как первый пассаж в большинстве случаев
не вызывает гибели или изменения эмбрионов.
    Идентификацию вируса проводят на 9-суточных куриных эм­
брионах в реакции нейтрализации (P H ), используя известные спе­
цифические антисыворотки как минимум к двум основным серо­
типам вируса (Massachusets, Connecticut) с индексом нейтрали­
зации антисывороток более 3 lg (см. п. 2.2.3.1), или в реакции
нейтрализации в культуре клеток почек куриных эмбрионов или
фибробластов (см. п. 2.2.3.2).
                                                              17

Стр. 3 ГОСТ 25583— 83

    2.1.4. Обработка результатов
    2.1.4.1. Вирус считают идентифицированным и результат поло­
жительным, если эмбрионы, инокулированные смесью испытывае­
мого вируса со специфической антисывороткой, остаются живыми
и развиваются нормально, а эмбрионы, инокулированные только
испытываемым вирусом, погибают или отстают в развитии; у эм-*
брионов наблюдается перекручивание тела, сворачивание тела в
шар, уменьшается количество амниотической жидкости, оболочки
плотно прилегают к эмбриону.
    В культуре клеток при положительной реакции специфическая
антисыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный ви­
русом инфекционного бронхита.
    2.1.4.2. При получении отрицательного результата в реакции
нейтрализации (это может быть связано с неспецифичностью ис­
пользуемой антисыворотки к присутствующему серотипу вируса—
Massachusets, Connecticut) проводят реакцию преципитации в
агаровом геле (РПАГ) по п. 2.2.3.3.
     2.2.    Серологический метод
     Сущность метода заключается в выявлении у переболевшей
 птицы специфических антител в реакции нейтрализации (PH) и
 реакции преципитации в агаровом геле (РПАГ).
     2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы
     Для проведения исследования применяют:
     баню водяную;
     термостат с температурой нагрева 37—38°С;
     центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин;
     пробирки вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 25336—82;
     пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по
 ГОСТ 20292—74;
     чашки Петри по ГОСТ 25336—82;
     штамп для изготовления лунок в агаре;
     воронку по ГОСТ 25336—82;
      пенициллин;
     стрептомицин;
      агар очищенный;
      мединал;
      куриные эмбрионы 9-суточного возраста;
      культуры клеток почек куриных эмбрионов, выращенные на
 среде с 10%-ной телячьей сывороткой;
      среды питательные для культуры клеток;
      антисыворотки типоспецифические к инфекционному бронхиту,
  положительные;
      штаммы эталонные вирусов инфекционного бронхита разных
  антигенных типов;
      натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,87%-ный раствор;
      воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.
   18

ГОСТ 25583— ВЗ Стр. 4


    2.2.2. Подготовка к исследованию
    Пробы сыворотки крови инактивируют прогреванием при тем­
 пературе 56°С в течение 30 мин. Загрязненную сыворотку фильт­
руют через бактериальные фильтры или обрабатывают антибио­
тиками.
    2.2.3. Проведение исследования в реакции нейтрализации на
куриных эмбрионах
     2.2.3.1. В реакции используют вирус с титром не ниже 107
ЭИД 50/1 см3. Готовят серийные десятикратные разведения виру­
 са от 10“3 до 10-* Равные количества разведенного вируса, спе­
цифических антисывороток и испытываемых сывороток крови сме­
шивают и смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре. .
    Каждым разведением инокулируют по четыре куриных эмбрио­
на 9-суточного возраста в аллантоисную полость в дозе 0,2 см3.
Инокулированные куриные эмбрионы овоскопируют ежедневно в
течение 3—8 сут (в зависимости от используемого штамма); по­
гибшие эмбрионы в течение первых 24 ч не учитывают.
    2.2.3.2. Обработка результатов
    По истечении 3—8 сут определяют инфекционный статус каж­
дой группы инокулированных куриных эмбрионов и вычисляют
ИД 50 . Разница между логарифмами титра контрольного ряда ви­
руса и титра смеси вируса с испытываемой сывороткой выражает
индекс нейтрализации.
    При значениях индекса нейтрализации от 0,0 до 1,0 результат
реакции считают отрицательным, от 1,1 до 2,0 — сомнительным,
от 2,1 и выше — положительным.
    Если для 20 и более процентов испытываемых сывороток кро­
ви получится сомнительный результат, исследование проводят в
реакции преципитации в агаровом геле. При получении сомни­
тельных результатов проводят исследование сывороток крови,
полученных при повторном взятии крови от птицы на 14—21 сут.
Вируснейтрализуюшие антитела образуются через 2—3 недели
после вспышки заболевания и сохраняются пожизненно, а преци-
питирующие антитела — от 2 до 7 недель после начала зараже­
ния.
    2.2.4. Проведение исследования в реакции нейтрализации на
культурах клеток
    2.2.4.1. Берут свежеполученную культуру клеток при образо­
вании сплошного монослоя и адаптированный к культурам кле­
ток вирус с титром 5—5,5 ед/см3.
    Готовят серийные 10-кратные разведения вируса до 10~б. Каж­
дое разведение вируса смешивают с равным количеством типоспе­
цифической сыворотки. Если в реакции используются кроличьи
контрольные сыворотки (положительная и отрицательная), их раз­
водят до 10-1, так как неразведенные сыворотки вызывают неспе-
                                                             19