ГОСТ 20909.6-75

УД К 619:611-013.11:577.1[0ВЭ.74)                                                 Групп* P i*

        Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й                        С Т А Н Д А Р Т     С О Ю З А     ССР




                                 СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ
                                 Методы биохимически* исследований                   ГОСТ
                                      Non-diluted spern of bulls.
                                      Methods of biochemicaltcsls              2 0 9 0 9 .6 -7 5


            Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР
            от 19 сентября 197S г. Н* 2440 срок действия установлен
                                                                             С 01.07.76
                                                                            до oi.otTh
                                       Несоблюдение стандарта преследуется по аакоиу


                  Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную евс-
              жеполученную сперму быков и устанавливает методы биохими­
              ческих исследований с целью определения содержания аденозин-
              фосфатов в спермиях и микроэлементов и кетоновых тел в спер­
              ме.

                                                    1.   МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

                 1.1. 07 бор проб — по ГОСТ 20909.1—75.
                 1.2. Для проведения испытаний применяют свежеполучениук>
              сперму, хранившуюся при температуре 30—35°С не более 30 мин.

                                               2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ
                                              АДЕНОЗИНФОСФАТОв I СПЕРМИЯХ

                 Сущпость метода заключается в определении содержания ла­
              бильного фосфора, освобожденного при гидролизе аденозинтри-
              фосфорной и адсмознндифосфорной кислот, предварительно адсор­
              бированных на активированном угле.
                 2.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы
                 2.1.1. Для проведения испытания применяют:
                 центрифугу;
                 шкаф сушильный лабораторный по ГОСТ 7365—55;
                 фотоэлёктроколориметр;
                 баню водяную;
                 пробирки центрифужные;
                 И1 дамке официальное                                          Перепечатка воспрещен»

                                                                                                    35
разработка технических условий

Ctp. 2 ГОСТ 2W e*.*-7J


     холодильнички;
      воронки стеклянные по ГОСТ 8613—64;
     пипетки стеклянные градуированные вместимостью 2 и 5 мл
 по ГОСТ 12487—67;
     уголь активированный марки БАУ по ГОСТ 6217—74;
     фильтры бумажные по ГОСТ 12026—66;
     кислоту трнхлоруксусную, х. ч.;
     спирт этиловый ректификованный по ГОС7 ^962—67;
     кислоту соляную по ГОСТ 3118—67, х.ч.;
     кислоту серную по ГОСТ 4204 —66, х. ч.;
     аммоний молибденовокислый по ГОСТ 3765—72, х.ч.;
     кислоту аскорбиновую по ГОСТ 4815—54. х.ч.;
     калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198—75,
 х. ч.;
     воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.
     2.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю
     2.2.1. Подготовка активированного угля
     К Ю0 г тщательно растертого угля добавляют 500 мл 3 н. соля­
 ной кислоты. Смесь кипятят в течение 60 мин, затем кислоту уда­
ляют фильтрованием. Уголь заливают 1 л дистиллированной во­
 ды, кипятят в течение 60 мин,-фильтруют через фильтровальную
 бумагу. Эту операцию повторяют три раза. Промытый уголь высу­
 шивают при температуре 140°С. Затем еще раз проводят трехкрат­
 ное кипячение активированного угля с 1 л дистиллированной во­
 ды в течение 40 мин с последующим фильтрованием. Уголь на
 фильтре промывают горячей дистиллированной водой до получе­
 ния фильтрата с pH 4, затем уголь высушивают при температуре
 140"С.
     2.2.2. Построение градуировочного графика
     Из 'перекристаллизонанного однозамещенного фосфата калия
 готовят основной раствор фосфора.
     Перекристаллизацию фосфата калия ведут, охлаждая при 2—
5°С профильтрованный через двойной бумажный фильтр горячий
насыщенный раствор фосфата калия, который приготавливают на
биднетиллировапной воде. Выпавшие кристаллы высушивают в
течение трех-четырех дней при температуре 36—3 7 Т до постоян­
ной массы. Растворяют 0,4394 г перекристаллизованного фосфата
калия в мерной колбе вместимостью 1 л и доливают дистиллиро­
ванной водой до метки. Приготовленный раствор перемешивают.
 1 мл основного раствора содержит 0,1 мг фосфора.
     Для построения градуировочного графика из основного раст­
вора фосфора готовят ряд разведений. Д ля этого в мерные колбы
 вместимостью 100 мл помещают соответственно 1, 2, 3, 4, 5 мл ос­
новного раствора. Колбы доливают бидистиллированной водой до
метки и тщательно перемешивают. В 1 мл каждого из приготов­
ленных растворов будет содержаться соответственно 2, 3, 4, 5 мкг
36

ГОСТ 2W09.*— п   Сгр. 3

 фосфора. Из каждой колбы в пробирки берут 1 мл раствора фос­
 фата калия, добавляют 1 мл 2,5%-ного молибдата в 5 н. растворе
 серной кислоты и I мл 0.5%-ного свежеприготовленного раствора
 аскорбиновой кислоты. Объем раствора в пробирках доводят би-
 дистиллированной водой до 10 мл. Пробирки ставят на водяную
 баню при ЗГС на 10 мин и затем охлаждают. Оптическую плот­
 ность растворов измеряют на фотоэлектроколориметре при крас­
 ном светофильтре в кюветах с рабочей длиной, против бидистил-
 лмрованной воды 10 мм.
     По полученным значениям оптической плотности растворов
строят градуировочный график. Для этого по оси абсцисс откла­
дывают численные значения концентрации фосфора, а по оси ор­
динат — соответствующую оптическую плотность раствора. Точ­
 ки пересечения восстановленных перпендикуляров соединяют ли­
лией.
    Градуировочный график строят для каждого фотоэлектроколо-
 р иметра и проверяют его ежемесячно.
    2.2.3. Определение концентрации спермиев в сперме - - по
 ГОСТ 20909.5-75.
    2.3. П р о в е д е н н е и с п ы т а н и я
    2.3.1.     К пробе спермы (независимо от ее объема) с содержани­
ем не менее 400 млн спермиев добавляют равный объем 20%-ной
трихлоруксусиой кислоты.
    Пробы ставят на 1 ч в холодильник при температуре 2—3*С.
помешивая через каждые 10—15 мин. По истечении указанного
срока к исследуемому материалу добавляют равный объем .ди­
стиллированной воды (концентрацию трихлоруксусиой кислоты
доводят таким образом до 5% ), тщательно размешивают стеклян­
ной палочкой и центрифугируют в течение 7—10 мин при частоте
вращения 3—4 тыс. об/мин.
    Центрифугат сливают в центрифужные пробирки или в чистые
флаконы вместимостью 10—15 мл, в которые предварительно по­
мещают но 250 мг специально подготовленного активированного
угля. Параллельно с опытными пробами ставят контрольные: в
две пробирки, содержащие по 250 мг угля, вместо цепгрнфугата
вносят по 4 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты.
    Пробирки с центрифугатом и углем, а также контрольные про­
бирки ставят в холодильник на 20 мин, перемешивая их содержи­
мое не менее двух раз. Д ля лучшего оседания угля к смеси добав­
ляют 0,2—0,3 мл этилового спирта. Смесь центрифугируют в те­
чение 10—15 мин при частоте вращения 3— 4 тыс. об/мпн.
    Центрифугат сливают и уголь дважды промывают. В начале
добавляют 5 мл дистиллированной воды и 0,2—0,3 мл спирта.
Смесь центрифугируют при частоте вращения 2—3 тыс. об/мин в
течение 3—6 мин и центрифугат сливают. Вторично осадок лро-
                                                                37

Стр. 4 ГОСТ Х т 9 Л — 7!

кивают без добавления спирта (осадок каждый раз помешивают
стеклянной палочкой).
    К промытому осадку добавляют 0.5 мл 2 н. раствора соляной
кислоты и 2 мл 1 и. раствора соляной кислоты. Смесь гидролизу­
ют 10 мин на кипящей водяной бане в пробирках, закрытых хо­
лодильничками. Пробирки с раствором охлаждают до 18—20'С,
добавляют 2 мл дистиллированной воды, перемешивают и центри­
фугируют 5—7 мин при частоте вращения 3—4 тыс. об/мин. Цент-
рифугат отфильтровывают через бумажный фильтр.
   Фильтрат в количестве 2 мл переносят в чистые пробирки или
флаконы, добавляют 1 мл 2,5%-ного раствора молибденовокисло­
го аммония, приготовленного на 5 н. серной кислоте и 1 мл 0,5%-
ного раствора свежеприготовленной аскорбиновой кислоты. Ра­
створ доливают до 10 мл дистиллированной водой, ставят на во­
дяную баню при 37°С на 10 мин и затем охлаждают. Охлажден­
ный раствор колориметрируют на фотоэлектроколорлметрс при
красном светофильтре против контрольных растворов в кюветах с
рабочей длиной 10 мм.
   2.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в
   2.4.1.    Оптическую плотность (Dt) в пересчете на 1 млрд спер-
мнев вычисляют по формуле


где D — оптическая плотность исследуемого раствора;
     с — концентрация спермиев в сперме, млрд/мл;
   2,5 — коэффициент пересчета.
   Содержание фосфора аденозинтрифосфорной и адснозинднфос-
форной кислот в I млрд спермиев в микрограммах определяют по
градуировочному графику, находя значение фосфора по соответ­
ствующей величине оптической плотности.
   За окончательный результат испытания принимают среднее
арифметическое результатов двух параллельных определений. До­
пускаемые расхождения между результатами параллельных опре­
делений не должны превышать ±10%.
        3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В СПЕРМЕ
   Содержание микроэлементов в сперме определяют химическим
или спектральным методом.
   3.1. Х и м и ч е с к и й метод определения       микро­
элементов
   Сущность метода заключается в выделении микроэлементов нз
спермы и последующем колорнметрировании растворов, содержа­
щих микроэлементы.
   3.1.1. Оборудование и реактивы
   Для проведения испытания применяют:
   фотоэлектроколориметр;
38