ГОСТ 13496.21-87

ГОСТ 13496.21-87

                        М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й              С Т А Н Д А Р Т




                                  КОРМА, КОМБИКОРМА,
                                 КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
                            МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗИНА И ТРИПТОФАНА



                                            Издание официальное




                                                       Москва
                                                  С та нд арти нф ор м
                                                         2011




лаборатория испытаний

УДК 636.085.3:006.354                                                                          Группа С 19

М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й                                            С Т А Н Д А Р Т


        КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
                                                                                     ГОСТ
                 Методы определения лизина и триптофана
                                                                                 13496.21 -8 7
                       Feeds, mixed feeds and raw material.
              Methods for determining content of lisin and tryptophane

МКС 65.120
ОКСТУ 9209

                                                                                     Дата введения 01.07.88

     Настоящий стандарт распространяется на все виды кормов, комбикорма и комбикормовое
сырье и устанавливает хроматографические и колориметрический методы определения в них ами­
нокислот лизина и триптофана.
     Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, лабораторий агрохими­
ческой службы, республиканских и зональных лабораторий комбикормовой промышленности.
                                       1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
     1.1. Отбор проб - по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3. ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681.
         2. МЕТОД ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
                    (НА АВТОАНАЛИЗАТОРЕ АМИНОКИСЛОТ)
     2.1. Сущность метода заключается в расщеплении пептидных связей белка соляной кислотой
или щелочью при нагревании и избирательной сорбции аминокислот на ионообменнике жидкостной
хроматографической колонки. При реакции с нингндриновым реактивом образуется окрашенный
комплекс, интенсивность которого пропорциональна содержанию аминокислоты в растворе.
     2.2. Средства испытаний
     Для проведения испытания применяют:
     измельчитель проб растений ИПР-2:
     сушилку проб кормов СК-1 или шкаф сушильный лабораторный, обеспечивающий погреш­
ность поддержания температуры не более 5 'С;
     мельницу лабораторную марки МРП-2;
     сито с отверстиями 1 х 1 мм или диаметром I мм;
     весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом взвешивания 200 и
500 г по ГОСТ 24104*;
     автоклав по ГОСТ 14106;
     шкаф сушильный типа СЭШ-ЗМ или аналогичный с рабочей температурой 110 "С. максималь­
ным перепадом температур 2 'С и периодическим колебанием температур в рабочей зоне ±0,5 *С;
     аминокислотный анализатор;
     устройство для выпаривания гидролизатов УВГ-1;
     холодильник бытовой;
     pH-метр 340;
     дозатор стеклянный вместимостью 10 см3;
     газовую горелку однопламенную универсальную по ГОСТ 1077;
     баллон с газом пропан-бутан;
     ампулы стеклянные с перетяжкой вместимостью 20 см3 по ГОСТ 21400;
    ♦ С I июля 2002 г. введен вдсПсгвис ГОСТ 24104—2001. Натерритории Российской Федерации действует
ГОСТ Р 53228-2008 (здесь и далее).

Издание официальное                                                                Перепечатка воспрещена
                                                                         £> Издательство стандартов, 1987
                                                                           €> СТАНДАРТИНФОРМ, 2011
                                                  168

ГОСТ 13496.21-87 С. 2

     колбы мерные исполнений I и 2 вместимостью 50, 100, 1000 см3 2-го класса точности по
ГОСТ 1770;
     пробирки стеклянные вместимостью 20 см3 по ГОСТ 1770;
     пипетки градуированные исполнений 1, 2. 4. 5, 6 вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 2-го класса точ­
ности по ГОСТ 29227;
     воронки стеклянные диаметром 4—6 см по ГОСТ 25336;
     ступку фарфоровую:
     фильтры беззольные с синей полосой диаметром 8 см по ГОСТ 12026:
     набор реактивов к аминокислотному анализатору;
     набор аминокислот стандартный;
     кислот)' соляную концентрированную по ГОСТ 3118, х. ч. и раствор соляной кислоты с кон­
центрацией 6 моль/дм3: готовят смешиванием равных объемов концентрированной соляной кисло­
ты и дистиллированной воды (1:1);
     спирт этиловый по ГОСТ 5962*;
     бария гидроокись. 8-водную по ГОСТ 4107. х. ч.;
     натрий углекислый безводный по ГОСТ 83, х. ч., раствор с массовой долей 10 %;
     натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280. х. ч. или ч. д. а.;
     фенол;
     натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч., раствор с массовой долей 50 %;
     пропанол-2 (изопропиловый спирт);
     воду дистиллированную по ГОСТ 6709.
     П р и м е ч а н и е . Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду или другие мерные средства
измерения, имеющие аналогичные метрологические характеристики.
      2.3. Подготовка к испытанию
      2.3.1. П о д г о т о в к а п р о б
      Среднюю пробу сена, сенажа, соломы или зеленой массы, отобранную по ГОСТ 27262, из­
мельчают на отрезки длиной до 1—3 см. Корнеплоды разрезают на пластинки (ломтики) толщиной
до 0.8 см. Методом квартований выделяют часть средней пробы, масса которой после высушивания
должна быть нс менее 100 г. Высушивание проб проводят в сушильном шкафу при температуре
60—65 “С до воздушно-сухого состояния. После высушивания воздушно-сухую пробу размалывают
на мельнице и просеивают через сито. Остаток на сите измельчают ножницами или в ступке, добав­
ляют к просеянной части и тщательно перемешивают.
      Средние пробы комбикормов, зерна, жмыхов, шротов, гранул, травяной муки или витамин­
ной муки из древесной зелени размалывают без предварительного подсушивания и просеивают
через сито.
      Подготовленные пробы хранят в стеклянной или пластмассовой байке с крышкой в сухом тем­
ном месте.
      2.3.2. П р и г о т о в л е н и е р а с т в о р о в и р е а к т и в о в
      2.3.2.1. Приготовление буферного раствора с pH 2,2
      19,6 г лимоннокислого трехзамещенного натрия растворяют в 200—300 см3 дистиллированной
воды, приливают 16.6 см3 концентрированной соляной кислоты, I см3 фенола и объем доводят до
1 дм3 в мерной колбе дистиллированной водой. Концентрацию водородных ионов контролируют на
pH-метре и при необходимости корректируют раствором гидроокиси натрия с массовой долей 50 %
или концентрированной соляной кислотой.
      2.3.2.2. Приготовление нейтрализующего раствора
      10 г гидроокиси натрия растворяют в буферном растворе с pH 2,2. охлаждают и доводят объем
до метки в мерной колбе вместимостью 100 см3.
      2.3.2.3. Приготовление стандартного раствора лизина
      Навеску (156з0.1) мг монохлорида лизина растворяют в 50 см3 соляной кислоты с концентра­
цией 0,1 моль/дм3 (3.1 см3 концентрированной соляной кислоты растворяют в 1000 см3 дистилли­
рованной воды). I см3 такого раствора содержит 2.5 мг чистого лизина.
      2.3.2.4. Приготовление стандарпиюго раствора триптофана
      Навеску (12510.1) мг триптофана растворяют в водном растворе изопропанола (1:9) в мерной
колбе вместимостью 50 см3. 1 см3 такого раствора содержит 2,5 мг триптофана.
      Рабочие стандартные растворы аминокислот готовят из основных разведением в буфере с pH
2,2 для лизина и водном растворе изопропанола — для триптофана.
     * В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652—2000 (здесь и далее).
                                                     169

С. 3 ГОСТ 13496.21-87

     2.4. Провеление испытания
     2.4.1. П о д г о т о в к а г и д р о л и з а т о в
     2.4.1.1. Проведение кислотного гидролиза в растворе соляной кислоты концентрации 6 моль/дм3
для определения лизина
     а) Гидролиз в термостате
      Навеску воздушно-сухого корма массой ( 100±0,1) мг аккуратно переносят на дно ампулы с пе­
ретяжкой, добавляют 2—3 капли этилового спирта и дозатором приливают 10 см3 раствора
6 моль/дм3 соляной кислоты. Ампулу запаивают в пламени газовой горелки в месте перетяжки,
устанавливают в штатив и помешают в предварительно нагретый до температуры 110 *С сушильный
шкаф на 24 ч. После завершения гидролиза ампулы охлаждают до комнатной температуры, взбал­
тывают и содержимое переносят на беззольный фильтр.
     2 см3 фильтрата выпаривают досуха и осадок растворяют в 10 см3 буферного раствора с pH 2.2
или добавляют 5 см3 нейтрализующего раствора. Содержимое перемешивают. Гидролизат готов для
нанесения на хроматографическую колонку.
     б) Гидролиз в автоклаве
      Навеску воздушно-сухого корма массой <100±0,1) мг аккуратно переносят на дно пробирки
вместимостью 20 см3, добавляют 2—3 капли этилового спирта и дозатором приливают 10 см3 рас­
твора 6 моль/дм3 соляной кислоты. Пробирки закрывают стеклянными колпачками или воронками
для предотвращения разбрызгивания кислоты во время гидролиза и помещают в автоклав. Гидролиз
проводят при давлении 0.25 МПа и температуре 137 *С в течение 3 ч. После завершения гидролиза
пробирки охлаждают до комнатной температуры, осторожно взбдзтывают и содержимое переносят
на беззольный фильтр. 2 см ' фильтрата выпаривают досуха и приливают 10 см ' буферного раствора
с pH 2,2 или добавляют 5 см3 нейтрализующего раствора. Содержимое перемешивают. Гидролизат
готов для нанесения на хроматографическую колонку.
     2.4.1.2. Проведение гидролиза с гидроокисью бария для определения содержания триптофана
      Навеску воздушно-сухого корма массой (200±0,1) мг аккуратно переносят на дно ампулы с пе­
ретяжкой, добавляют 2—3 капли этилового спирта. 1.6 г свежерастертой в фарфоровой ступке гид­
роокиси бария и содержимое тщательно перемешивают. Затем приливают 3.0 см3 дистиллирован­
ной воды на каждую пробу. Ампулы запаивают в месте перетяжки в пламени газовой горелки и
помешают в предварительно нагретый до температуры 110 *С сушильный шкаф на 18 ч. По оконча­
нии гидролиза ампулы тщательно встряхивают, охлаждают до комнатной температуры и помешают
в холодильник на 1,5—2 ч для осаждения ионов бария.
      Метолом обратного фильтрования отбирают из пробирки 1 см3 надосадочной жидкости и при­
ливают равный объем раствора углекислого натрия с массовой долей 10 % для осаждения оставше­
гося бария. Пробирки с гидролизатами закрывают пробками и хранят в холодильнике.
      Перед нанесением на хроматографическую колонку pH гидролизатов доводят до 2,2. Для этого
берут аликвотную часть гидролизата, подкисляют ее концентрированной соляной кислотой до pH
2,2 и приливают равный аликвотной части гидролизата объем буферного раствора с pH 2,2. При
расчете учитывают данный фактор разведения.
     2.4.2. П р о в е д е н и е а н а л и з а
      Гидролизаты наносят на колонку автоанализатора аминокислот. Для сравнения испытуемых
гидролизатов используют рабочий стандартный раствор аминокислоты. Анализ проводят по ко­
роткой программе с использованием буферного раствора для идентификации основных амино­
                               кислот в соответствии с правилами проведения анализа на аминоана-
                               лизаторах.
                                    В результате получают хроматограммы с пиками кривых, площа­
                               ди которых пропорциональны концентрациям аминокислот.
                                    Для расчета площади пика на хроматограмме проводят базовую
                               линию, касательную к двум основаниям, и высоту И, проходящую че­
                               рез вершину кривой параллельно оси ординат. На уровне, равном по­
                               ловине высоты, проводят линию, параллельную базовой. Отрезок, от­
                               секаемый на этой линии кривой, называется полушириной пика Ь (см.
                               чертеж). Площадь пика Sr в квадратных миллиметрах вычисляют по
                               формуле
                                                         S ,= И ■Ь.
                                           170