ГОСТ 10444.7-86

ГОСТ 10444.7-86


             М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й               С Т А Н Д А Р Т




                         ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
              МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ И
                         CLOSTRIDIUM BOTULINUM



                                  Издание официальное




                                        С 1 Ш Щ * р т ^ О |И
                                              2010




скачать ту

Группа Н09

М   Е   Ж   Г    О   С    У   Д   А   Р   С   Т   В    Е   Н    Н    Ы      Й       С Т А Н Д А Р Т


                          ПРОДУКТЫ ПИЩ ЕВЫ Е                                                   ГОСТ
                Методы выявления ботулиннческих токсинов и                                 10444.7-8 6
                          Clostridium botulinum.
                                                                                             Взамен
                 Food products. Methods for detection of botulinal                       ГОСТ 1 0 4 4 4 .7 -7 5
                        toxins and Clostridium botulinum                                 ГОСТ 1 0 4 4 4 .8 -7 5

МКС 07.100.30
ОКСТУ 9109

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 12 мая 1986 г. № 1214 дата введения
установлена
                                                                                          01.07.87


     Настоящий стандарт устанавливает методы выявления в пищевых продуктах ботулиннческих
токсинов всех типов, вегетативных клеток и спор токсигенных штаммов Clostridium botulinum, опре­
деления титра ботулиннческих токсинов, серологического типирования токсина и выделения культур
токсигенных штаммов С. botulinum типа А. В, С, D , Е, F и G.
     Метод выяапения ботулиинческого токсина и определение его титра основан на выявлении сим­
птомов клинической картины болезни it гибели животных, характерных для ботулинической интокси­
кации.
     Серологическое тнпированне токсина С. botulinum осуществляется на белых мышах путем поста­
новки защитного теста in vivo или реакции нейтрализации in vitro с диагностическими протнвоботулм-
нистическимм типоспецифическими антитоксическими сыворотками.
     Метод выявления С. botulinum основан на его способности развиваться и образовывать ботулини-
ческие токсины в питательных средах для анаэробных микроорганизмов.
     Выделение культур токсигенных штаммов С. botulinum из продукта или культу ральной жидкости
проводят путем высева на твердые питательные среды с последующим исследованием культуральных и
морфологических признаков, характерных для С. botulinum и определением способности выделенной
культуры образовывать ботулииический токсин.
     Методы предназначены:
     для исследования продуктов по санитарно-эпидемиологическим показаниям:
     для анализа посевов продуктов, в случае обнаружения в них мезофильных анаэробных микроор­
ганизмов.
     Исследования проводят в лабораториях, указанных органами здравоохранения.
     Термины, применяемые в настоящем стандарте, и пояснения к ним приведены в приложении I.
     Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 5211—65.

                              1. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКА ПРОБ

      1.1. Методы отбора проб пищевых продуктов - по ГОСТ 26668—85 и в соответствии с требова­
нием приложения 4. Пробы пищевых продуктов подготавливают к анализу по ГОСТ 26669—85. Кон­
сервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18—70 и термостатируют по
ГОСТ 2 6 6 6 9 -8 5 .
      1.2. Термостатированию не подлежат: консервы и полуконсервы в негерметичной таре, б о м б а х -
ные, хлопуши, консервы с видимыми невооруженным глазом признаками развития микроорганизмов
и предназначенные для одновременного выявления ботулиннческих токсинов и С. botulinum или
только ботулиннческих токсинов.

Издание официальное                                                                      Перепечатка воспрещена
          ★
                                           П ереиздание. А прель 2 010 г.

                                                                         Ci ИН К Издательство стандартов. 1986
                                                                                С СТАНДАРТИНФОРМ , 2010
                                                        247

С. 2 ГОСТ 1 0 4 4 4 .7 -8 6

                     2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И РАСТВОРЫ

      2.1.       Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы, реактивы и растворы по
ГОСТ 1 0 444.1-84. а также аппаратуру, материалы, реактивы и растворы, указанные ниже:
     анаэростат;
     аппарат для встряхивания;
     баллоны с талами (азот, водород, гелий или смесью: азот 80 %. углекислый газ — 10 %.
водород - 10 %):
      весы аналитические;
     грушу резиновую;
     доски для сушки посуды;
     ерши дтя мойки посуды;
      корзинки проволочные луженые для стерилизации;
      микроскоп биологический с приспособлением для фазовоконтрастного ми крое коп про ва н ия;
      микропипетки;
      пестик для фарфоровой ступки;
      петли бактериологические;
     пипетки пастеровские;
      пробирки центрифужные вместимостью 10—100 см ?;
     размельчитель тканей лабораторный,
     редукторы к баллонам с газом;
     стекла предметные по ГОСТ 9 2 8 4 -7 5 ;
     стекла покровные по ГОСТ 6 6 7 2 -7 5 ;
     фильтры асбестовые, керамические, мембранные;
     флаконы вместимостью 100—500 см';
     футляры металлические для стерилизации пипеток, чашек Петри, шприцев;
      штативы дтя пипеток;
      штативы для пробирок;
     бумагу индикаторную;
     дуршлаг;
      масло иммерсионное;
      перчатки резиновые;
     фильтр тканевый;
      мышей белых массой 15—20 г одного пола;
     бриллиантовый зеленый, раствор: 0 ,5 - 1 .0 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см3 эти­
лового спирта. Применяют дтя метки белых мышей;
      кдтьций углекислый стерильный готовят по ГОСТ 10444.1 - 8 4 . Добавление углекислого кальция
к средам с глюкозой способствует образованию спор С. botulinum;
      кислоту' аскорбиновую, раствор массовой концентрацией 50 г/дм 3: 5 г аскорбиновой кислоты
переносят в мерную колбу вместимостью 100 см'.доводят объем дистиллированной водой до метки,
растворяют и стерилизуют фильтрованием, используя фильтры со средним диаметром пор
0,40—0,45 мкм. Раствор следует применять свежеприготовленным. Допускается использовать без стери­
лизации раствор аскорбиновой кислоты для инъекций. Применяют в качестве восстановителя, связы­
вающего кислород в питательных средах для С. botulinum;
     кислоту молочную, L - форма по ГОСТ 4 9 0 -2 0 0 6 ;
      кислоту пикриновую, раствор: 2,5 пикриновой кислоты растворяют в 100 см3 воды при нагрева­
нии. Применяют для метки белых мышей;
      кислоту соляную по ГОСТ 3118—77, раствор с массовой долей соляной кислоты 4 %. Применяют
для подкисления питательных сред;
      масло вазелиновое по ГОСТ 3 1 6 4 -7 8 или подсолнечное по ГОСТ 1129—93*; масло вазелиновое
рахливают в колбы по 20—50 см3 и стерилизуют горячим воздухом в стерилизаторе в течение 60 мин
при температуре 140 ‘С; масло подсолнечное прокаливают при температуре (160± I) "С горячим возду­
хом в стерилизаторе в течение 2 ч, охлаждают, фасуют в пробирки или колбы и стерилизуют при
температуре (121±1) *С в течение 30 мин;
     мальтозу;

       * На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52465—2005.

                                                 248

ГОСТ 1 0 4 4 4 .7 -8 6 С. 3

       малахитовый зеленый;
       медь сернокислую по ГОСТ 4165—78. 1 %-ный раствор. Применяют для постановки биуретовой
реакции в питательных средах;
       натрия гидроокись по ГОСТ 4328 -7 7 . раствор с массовой долей гидроокиси натрия 4 %. Приме­
няют для подщелачивания питательных сред;
       натрий углекислый по ГОСТ 8 3 - 7 9 . 0 ,3 —1 %-ный раствор. Применяют для кипячения игл для
шприцев (см. приложение 3);
       натрия тиогликолят;
       несши цин;
       перекись водорода по ГОСТ 1 7 7 -8 8 . раствор с массовой долей перекиси водорода 3 %;
       растворы фосфатного буфера:
       для приготовления фосфатного буфера готовят растворы:
       А — раствор однозамеш енного фосфорнокислого калия (К Н гР 0 4 — квалификации х. ч., дважды
пере кристаллизованный или для pH-метрии) массовой концентрацией 9,078 г/дм';
       Б — раствор двузамешенного фосфорнокислого натрия (N a2H P 0 4 • 2 Н ,0 квалификации х. ч..
дважды перекрнсталлизованный) массовой концентрацией 11,876 г/дм 5;
       для приготовления 100 с м ' фосфатного буфера:
       с pH 6.0 - к 12 см 3 раствора Б добавляют 88 см ' раствора А;
       с pH 6,2 - к 18,5 см 3 раствора Б добавляют 81,5 см ' раствора А;
       с pH 6.8 — к 50 см 5 раствора Б добавляют 50 см' раствора А,
       раствор фосфатного буфера с- pH 6.0 применяют для растворения трипсина;
       растворы желатино-фосфатного буфера:
       в 100 см' фосфатного буферного раствора с определенным значением pH вносят 0.6 г желатина,
дают набухнуть желатину и нагревают до полного растворения желатина. Стерилизуют при температуре
( 1 10±1) *С в течение 15 мин;
       раствор желатино-фосфатного буфера с pH 6,2 применяют в качестве стабилизатора ботулиничес-
ких токсинов. В случае выявления ботулннического токсина типа А переходят на расгвор желатино-
фосфатного буфера с pH 6,8:
       смесь реактивов для создания анаэробных условий готовят по ГОСТ 10444 .1 -8 4 . Допускается
использование талька вместо инфузорной земли;
       трипсин, раствор: 1,5 г трипсина растворяют в 100 см3 раствора фосфатного буфера с pH 6,0.
Раствор трипсина стерилизуют фильтрованием через керамический или мембранный фильтр с разме­
рами пор 0 ,4 0 -0 .4 5 мкм или другой эквивалентный фильтр. Стерильный раствор трипсина вносят в
регенерированную и охлажденную питательную среду асептически непосредствен но перед использова­
нием из расчета I см 3 раствора трипсина на 15 см 5 среды. Применяют для активизации протоксина С.
botulinum:
       гидролизат казеина ферментативный;
       фломастеры (применяют дзя метки мышей);
       циклосерин:
       эмульсию яично-желточную: свежие куриные яйца моют, ополаскивают холодной водой, опус­
кают в 70 %-ный спирт и высушивают. Разбивают каждое яйцо, соблюдая правила асептики, в
стерильную чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желтки в стерильную колбу или
флакон с четырьмя объемами стерильной воды и энергично перемешивают. Нагревают смесь на водя­
ной бане при температуре (45± 0,5) *С в течение 2 ч. оставляют на 1 8 -2 4 ч при температуре от 0 до
плюс 5 *С дзя того, чтобы сформировался осадок.
       С соблюдением правил асептики собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при темпера­
туре 0 - плюс 5 *С не более 72 ч. Применяют дня определения способности С. botulinum давать
положительную реакцию с яичным желтком.

                                   3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

     3.1.      При приготовлении питательных сред дзя выяазения и культивирования С. botulinum жидкие
и полужидкие среды разливают во флаконы или в пробирки таким образом, чтобы высота столбика
среды составляла не менее 10 см, объем среды - 3 0 - 100 см 3.
                                                249